【摘 要】
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山梨醇是一种可广泛应用于化工领域、食品与医药领域等的工业原料,利用合成生物学以及优化了的多酶反应体系生产山梨醇是一种较为绿色的制备方式,不仅可降低目前制备工艺对环境的污染,也可提高产品纯度。本研究利用体外合成生物学平台,构建由五个连续酶促反应和NADH再生的体外多酶催化体系,将麦芽糊精（maltodextrin,MD）转化为山梨醇,特别是,基于Rosetta Ligand的共价对接方法评价和筛选对
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山梨醇是一种可广泛应用于化工领域、食品与医药领域等的工业原料,利用合成生物学以及优化了的多酶反应体系生产山梨醇是一种较为绿色的制备方式,不仅可降低目前制备工艺对环境的污染,也可提高产品纯度。本研究利用体外合成生物学平台,构建由五个连续酶促反应和NADH再生的体外多酶催化体系,将麦芽糊精（maltodextrin,MD）转化为山梨醇,特别是,基于Rosetta Ligand的共价对接方法评价和筛选对山梨醇6-磷酸具有高特异性催化性能的山梨醇6-磷酸磷酸酶。用于山梨醇合成的多酶催化途径的六种酶分别是α-葡聚糖磷酸化酶（alpha-glucan phosphorylase,αGP）、葡萄糖磷酸变位酶（phosphoglucomutase,PGM）、葡萄糖6-磷酸异构酶（glucose6-phosphate isomerase,PGI）、山梨醇6-磷酸脱氢酶（sorbitol 6-phosphate dehydrogenase,S6PDH）、山梨醇6-磷酸磷酸酶（sorbitol 6-phosphate phosphatase,S6PP）和甲酸脱氢酶（formate dehydrogenase,FDH）。并将六种酶在大肠杆菌BL21（DE3）宿主中分别进行了表达优化以及后续通过亲和镍柱纯化这些酶,所获得纯酶再分别测定其催化活性。另外在进一步通过体系的配制和优化,以实现通过一锅反应将MD经过多级体外多酶体系转化为山梨醇。优化后多酶反应体系的转化率表明:28 mmol/L的麦芽糖糊精生物转化为山梨醇的产量为27.6 mmol/L,产率为98.6%。最后,为获得山梨醇的更高产量,增大麦芽糖糊精浓度至280 mmol/L,结果山梨醇的产量在第28 h仅为65.1 mmol/L。研究结果发现转化体系中存在严重的产物抑制,是山梨醇对S6PP具有较强的抑制作用,影响了山梨醇的生产。针对这种产物抑制情况,未来需要利用蛋白质工程对酶进行改造解除抑制,从而能够进一步提升山梨醇的产量。体外多酶催化系统平台为山梨醇的生产提供了一种生物精炼技术,具有可预测的安全性、环境友好性和可持续性,代表了一种非常有潜力的山梨醇生产替代方法。
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