论文部分内容阅读
多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs）和邻苯二甲酸酯类（phthalate esters,PAEs）是共存于环境中的典型持久性有机污染物。目前在多种生物样本（包括血、尿、乳汁、精液等）中已检出单羟基多环芳烃代谢物（monohydroxylated PAHs,OH-PAHs）和PAEs的代谢物。这两类化合物的代谢物已广为接受作为内暴露剂量来反映机体近期暴露PAHs和PAEs的水平。大量研究表明,PAHs或PAEs暴露可引起机体的炎性损伤、肺功能降低和生殖毒性。由于机体是持续复合暴露于环境污染物,因此很难将某种健康损害效应归于单一环境污染物的暴露。为此,有必要研究PAHs和PAEs复合暴露对机体健康的危害效应,为防控环境相关性疾病提供重要的科学依据。研究表明,衰老是心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病和癌症等疾病的主要危险因素,而暴露PAHs和PAEs对衰老也有影响,包括诱导机体的炎性反应、氧化应激反应、端粒功能和线粒体功能异常和肺功能降低等。但是,有关PAHs和PAEs复合暴露对衰老的影响及其机制仍有待深入研究。基于此,本研究首先基于一项固定群组研究的数据,包括冬（2014年12月2015年2月）、夏（2015年57月）两季社区居民的健康问卷信息和健康体检数据（包括白细胞计数、中性粒细胞、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数与淋巴细胞计数的比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio,NLR）、血小板计数与淋巴细胞计数的比值（platelet-to-lymphocyte ratio,PLR）和全身免疫–炎症指数（systemic immune-inflammation index,SII））,以及在冬、夏两季监测居室细颗粒物(particulates with an aerodynamic diameter≤2.5μm,PM2.5)期间收集的研究对象血尿样分析数据（包括连续三日尿OH-PAHs和PAEs的代谢物浓度、血浆炎性指标（白介素-6（interleukin-6,IL-6）和IL-8）水平）,氧化应激评价指标（血浆丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）、氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity,ORAC）、羟基抗氧化能力（hydroxyl radical antioxidant capacity,HORAC）和第三日尿8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG））、衰老指标（相对端粒长度（relative telomere length,RTL）、线粒体DNA拷贝数（mitochondrial DNA copy number,mtDNA-CN））和肺功能指标（一秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second,FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity,FVC）等）,评估了PAHs或PAEs单独及两者复合暴露与机体炎性反应、氧化应激和衰老等指标的相关性。随后,基于固定群组人群尿OH-PAHs和尿DEHP代谢物估计PAHs的典型代表物–苯并[a]芘的毒性当量（benzo[a]pyrene-equivalent toxicity,BaP-TEQ）浓度和PAEs典型代表物–邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（bis（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP）的每日摄入量（daily intake,DI）进一步评估了BaP和DEHP对机体产生的单一及联合致毒效应。最后,通过体外实验研究了DEHP和BaP联合染毒对肝细胞衰老的影响与调控机制。第一部分尿OH-PAHs和尿PAEs的代谢物与衰老表征的关联性研究目的:评估PAHs和PAEs复合暴露对机体的健康损害效应。方法:运用分层整群随机抽样方法,招募了武汉市两个社区1240名居民为本研究对象。基于此研究人群,设计了一项固定群组研究（n=120）。固定群组人群均完成了冬（2014年12月至2015年2月）、夏（2015年57月）两季的健康问卷调查和健康体检,并提供了血样和尿样。用高效液相色谱荧光检测器法、高效液相色谱-质谱联用法和高效液相色谱电化学检测法分别测定在两季收集的连续3日尿样中8种OH-PAHs、10种PAEs的代谢物和第三日尿8-OHdG的含量。用实时定量多聚酶链反应测定了外周血全基因组DNA的mtDNA-CN和RTL。用试剂盒测定了血浆MDA含量、GSH-Px活性、ORAC和HORAC。此外,用流式细胞微球芯片捕获技术（cytometric bead array,CBA）测定了血浆IL-6和IL-8水平。用线性混合效应模型和贝叶斯核机回归模型评估了PAHs或PAEs单一暴露及两者复合暴露与机体的炎性反应指标（白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、PLR、NLR、SII、IL-6和IL-8）、氧化应激指标（MDA、GSH-Px、HORAC、ORAC和8-OHdG）、衰老指标（mtDNA-CN、RTL）和肺功能指标（FEV1、FVC和FEV1/FVC）的相关性。基于测定的尿OH-PAHs和尿DEHP的代谢物浓度分别估计BaP-TEQ和DEHP的DI,进一步评估了估计的BaP-TEQ或DEHP的DI对机体的炎性反应、氧化应激和衰老的单一及两者的联合毒性效应。结果:线性混合效应模型揭示:尿OH-PAHs与RTL、尿高分子量PAEs的代谢物与mtDNA-CN均呈负相关。尿2+3-羟基菲浓度每增加一个自然对数单位（三日均值）,FEV1和FVC分别降低7.0%（95%CI:-10.7%,-3.2%）和3.5%（95%CI:-6.4%,-0.58%）。尿MEP或MEOHP浓度每增加一个自然对数单位（三日均值）,FEV1值对应增加5.0%（95%CI:1.4%,8.6%）或4.5%（95%CI:0.6%,8.6%）。贝叶斯核机回归模型揭示:8种尿OH-PAHs的代谢物与机体的炎性反应指标（中性粒细胞计数、NLR和SII）、氧化应激指标（MDA、GSH-Px、HORAC、ORAC和8-OHdG）呈正相关,但与机体的炎性反应指标（IL-6和IL-8）、衰老指标（RTL）、肺功能指标（FEV1、FVC）)则呈负相关;9种尿PAEs的代谢物与机体的炎性反应指标（淋巴细胞计数和IL-6）和肺功能指标（FVC）呈正相关,但与氧化应激指标（GSH-Px和HORAC）则呈负相关。尿PAEs的代谢物既可拮抗尿OH-PAHs对机体的炎性反应指标（中性粒细胞计数、NLR和SII）或氧化应激指标（GSH-Px和HORAC）的正向效应,又可拮抗尿OH-PAHs对机体的炎性反应指标（IL-6和IL-8）或衰老指标（RTL、FEV1和FVC）的负向效应。一定剂量尿PAEs的代谢物可削弱尿OH-PAHs对氧化应激指标（MDA、8-OHdG和ORAC）的正向效应。估计的DEHP的DI既可增强BaP-TEQ与IL-6、IL-8、RTL的负相关,也可增强BaP-TEQ与MDA、GSH-Px、8-OHdG的正相关。估计的BaP-TEQ和DEHP的DI对机体的炎性反应指标（PLR、SII）、抗氧化能力指标（HORAC和ORAC）呈交互作用。结论:一定剂量PAEs可能拮抗了PAHs诱导机体产生的炎性反应（中性粒细胞计数、NLR和SII的值增加）、脂质过氧化（MDA水平增高）和氧化性DNA损伤（8-OHdG水平增高）、抗氧化防御系统（GSH-Px、HORAC和ORAC的值增高）以及对衰老（RTL缩短、肺功能参数FEV1和FVC降低）的影响。估计的BaP-TEQ和DEHP的DI对HORAC、ORAC有正向交互作用,但对PLR、SII有负向交互作用。估计的DEHP的DI可增加估计的BaP-TEQ对mtDNA-CN的正效应和对RTL的负效应。第二部分ERK信号通路调控DEHP和BaP联合诱导细胞端粒功能异常目的:研究DEHP与BaP单一或联合处理人肝癌细胞株（human hepatocellular carcinoma,HepG2）对端粒异常的调控机制。方法:用DEHP（62.50μM、125.00μM、250.00μM、500.00μM和1000.00μM）、50.00μM BaP、二甲基亚砜（终浓度<0.1%,溶剂对照）分别单一和联合处理HepG2细胞24h和48h,检测受试细胞的炎性反应指标（IL-6和IL-8）、氧化应激指标（胞内和线粒体内活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）、HORAC、ORAC、GSH-Px和MDA）、线粒体功能(线粒体膜电位、mtDNA-CN、线粒体内Ca2+和线粒体质量)和衰老表征（RTL和mtDNA-CN）等的变化,以及去乙酰化酶（sirtuin 1,SIRT1）、端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase,TERT）、端粒保护蛋白1（TIN2-interacting protein 1,TPP1）、p38、p-p38、ERK和p-ERK蛋白的表达水平。用ERK信号通路抑制剂（10.00μM U0126）、500.00μM DEHP、50.00μM BaP分别单独和共处理HepG2细胞24h和48h,检测SIRT1、TPP1和TERT蛋白表达水平。结果:一定剂量DEHP和BaP联合染毒HepG2细胞可诱导IL-6和IL-8的分泌、MDA含量、GSH-Px酶活性、胞内和线粒体ROS生成量、线粒体内Ca2+水平、线粒体质量和膜电位和ATP含量的异常变化,并致IL-6和IL-8基因的mRNA表达上调、RTL的延长、mtDNA-CN的降低和细胞增殖抑制。一定剂量DEHP和BaP联合染毒致p-ERK和TPP1蛋白的表达上调,SIRT1和TERT蛋白的表达下调。500.00μM DEHP、50.00μM BaP、10.00μM U0126分别单一及三者共处理HePG2细胞48h显示,10.00μM U0126抑制了500.00μM DEHP与50.00μM BaP联合处理HepG2细胞致TPP1蛋白的表达上调和TERT与SIRT1蛋白的表达下调。结论:一定剂量DEHP（≥500.00μM）和50.00μM BaP联合染毒HepG2细胞24h致p-ERK蛋白的表达上调、TERT蛋白的表达下调以及RTL的延长。抑制ERK信号通路可削弱500.00μM DEHP和50.00μM BaP联合染毒致TERT蛋白表达下调的毒性效应。