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目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一,近年来其发病率仍有上升趋势,然而其确切的发病机制目前仍不十分清楚。随着分子生物学的发展,抑癌基因甲基化在肿瘤形成和发展中的作用越来越受到重视。抑癌基因RASSF1A和APC分别是Ras和Wnt信号途径中的分子,它们的甲基化在肝细胞癌发生中的作用以往已有一些研究报道,但是研究结论还很不一致,这两个基因的甲基化检测用于临床还存在一定问题;而抑癌基因WIF-1作为Wnt信号途径中的另一个分子,其在肝细胞癌发生、发展中的作用及临床意义的报道较少。抑癌基因RASSF1A,APC,WIF-1启动子区域的甲基化检测以往研究多采用新鲜组织,但新鲜组织长时间保存困难,大样本、长周期的研究受到限制,因此,本研究以石蜡包埋的肝细胞癌组织为标本,采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR, MSP)检测RASSF1A,APC和WIF-1基因的甲基化状态,分析与临床资料、病理学资料及生存期预后的关系,为抑癌基因RASSF1A,APC和WIF-1甲基化检测的临床应用提供理论依据,验证石蜡包埋肝细胞癌组织中RASSF1A和APC基因的甲基化状态的临床意义,阐明WIF-1基因甲基化在肝细胞癌发生、发展中的作用,以期用于临床诊断及预后判断。方法:1研究资料:收集自2002年1月～2010年6月于河北医科大学第四医院行肝胆外科手术治疗的肝细胞癌组织97例,癌旁肝硬化组织26例。97例肝细胞癌组织中男性81例,女性16例,年龄在24～75岁,平均年龄为55.69±10.21岁。所有标本常规石蜡包埋,HE染色,病理诊断由2名病理科医师诊断证实。收集所有患者相关病史、实验室检查结果、临床病理学资料和肿瘤家族史,通过电话联系或信访的方式对肝细胞癌患者随访其生存情况。2抑癌基因启动子区域的甲基化检测方法:蜡块组织总DNA采用传统的酚-氯仿方法提取,经亚硫酸盐处理后,用Wizard DNA纯化试剂盒纯化组织DNA,采用甲基化特异性PCR的方法对抑癌基因RASSF1A,APC和WIF-1进行目的片段的扩增,扩增产物通过电泳凝胶成像系统进行甲基化结果分析判定。3统计学分析:所有数据均使用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法,生存期采用Kaplan-Meier法计算,单因素分析采用Log-rank检验。均采用双侧检验,P<0.05有统计学意义。结果:1肝细胞癌和肝硬化组织中RASSF1A,APC,WIF-1基因甲基化表达及比较RASSF1A基因的甲基化率在肝细胞癌组及肝硬化组中分别为67.01%(65/97),42.31%(11/26),两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。APC基因在肝细胞癌组和肝硬化组中的甲基化率分别为63.92%(62/97),42.31%(11/26),两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。WIF-1基因在肝细胞癌组和肝硬化组中的甲基化率分别为46.39%(45/97),7.69%(2/26),两组差异有统计学意义(P<0.05)。2肝细胞癌患者中RASSF1A,APC,WIF-1基因甲基化与临床资料的比较RASSF1A基因的甲基化阳性率在男、女患者中的差异无统计学意义(P>0.05)。女性患者中APC基因甲基化阳性率为37.5%(6/16),低于男性的甲基化阳性率69.14%(56/81),差异有统计学意义(P<0.05)。WIF-1基因的甲基化阳性率女性为18.75%(3/16),低于男性的甲基化阳性率51.85%(42/81),差异有统计学意义(P<0.05)。RASSF1A,APC,WIF-1基因的甲基化阳性率与患者的年龄分组、肝功能Child-pugh分级和血清AFP值的大小间的差异无统计学意义(P>0.05)。HBsAg阳性组RASSF1A基因的甲基化阳性率为72.84%(59/81),HBsAg阴性组的甲基化阳性率为23.08%(3/13),两组间的差异有统计学意义(P<0.05);APC和WIF-1基因在HBsAg阳性和阴性组中的差异无统计学意义(P>0.05)。RASSF1A基因的甲基化阳性率在伴有肝硬化的组织中为71.11%(64/90),显著大于无肝硬化的组织14.28%(1/7),两组的差异有统计学意义(P<0.05);APC及WIF-1基因中的甲基化阳性率在有无肝硬化组中的差异无统计学意义(P>0.05)。3肝细胞癌患者中RASSF1A,APC,WIF-1基因甲基化与病理学资料的比较RASSF1A,APC,WIF-1基因的甲基化阳性率与肿瘤的个数及肿瘤直径无关(P>0.05)。有假包膜组RASSF1A,APC基因的甲基化阳性率与无假包膜组的差异无统计学意义(P>0.05);WIF-1基因的甲基化阳性率在有假包膜组为40%(30/75),显著低于无假包膜组68.18%(15/22),两组的差异有统计学意义(P<0.05)。门脉瘤栓的有无及临床分期两组中三个基因的甲基化阳性率的差异无统计学意义(P>0.05)。4肝细胞癌组织中RASSF1A,APC,WIF-1基因甲基化阳性表达的相互关系97例肝细胞癌中三个抑癌基因均未甲基化的占11.34%(11/97),至少有一个基因甲基化的占88.66%(86/97),同时有两个基因甲基化的占64.95%(63/97),三个基因均发生甲基化的占23.71%(23/97)。采用Pearson相关分析肝细胞癌组织中RASSF1A,APC,WIF-1基因甲基化表达的关联程度,发现三个抑癌基因甲基化表达均不存在相关关系(P>0.05)。5抑癌基因RASSF1A,APC,WIF-1的甲基化阳性表达与生存期预后关系对97例肝细胞癌患者进行电话或通信的方式随访其生存情况,随访至2011年3月,随访时间1～105月,其中9例患者失访。该组1年、2年、3年生存率分别为57.3%,42.1%,35.4%。RASSF1A基因甲基化阴性的肝细胞癌患者1年、2年、3年生存率分别为56.3%,43%,39.7%,甲基化阳性者1年、2年、3年生存率分别为57.8%,40.1%,31.6%;APC基因甲基化阴性者1年、2年、3年生存率分别为54.3%,31.4%,25.7%,甲基化阳性者1年、2年、3年生存率分别为59%,46.8%,39.5%;WIF-1基因甲基化阴性者1年、2年、3年生存率分别为57.6%,45.6%,37.3%,甲基化阳性者1年、2年、3年生存率分别为56.9%,35.7%,30.7%。单因素分析显示,RASSF1A,APC,WIF-1基因的甲基化状态间生存率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1石蜡包埋肝细胞癌组织中可检测到RASSF1A,APC和WIF-1基因甲基化,检测结果可靠,石蜡包埋组织的甲基化检测有其可行性。2肝细胞癌组织较肝硬化组织RASSF1A,APC,WIF-1基因甲基化率高,提示抑癌基因RASSF1A,APC和WIF-1的甲基化在肝细胞癌的发生中起到一定作用。3肝细胞癌组织中RASSF1A基因在HBsAg阳性组中的甲基化率高于HBsAg阴性组,在伴有肝硬化组中甲基化率高于不伴有肝硬化组,而APC和WIF-1基因的甲基化率与HBsAg感染和有无肝硬化无关,说明RASSF1A基因甲基化检测有望用于肝细胞癌高危人群的筛查。4抑癌基因RASSF1A,APC,WIF-1甲基化状态对肝细胞癌患者的生存期无显著影响,提示这三个基因的甲基化状态不能作为肝细胞癌预后预测因子。