镉对河南华溪蟹精子损伤作用及机理研究

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本论文采用急性毒性实验方法,研究了镉(Cd2+)染毒在河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)精子中的富集情况及引起的氧化损伤的作用以及对其形态、功能的影响。实验设置了1个空白对照组和5个Cd2+浓度组(7.25、14.5、29、58和116 mg/L),在3个染毒时间(3、5和7 d),检测精子活性氧含量(reactive oxygen species, ROS)及总抗氧化能力(total antioxidant capacity, TAC)的变化。同时,还检测了脂质过氧化程度(malondialdehyde, MDA),蛋白羰基化程度(protein carbonyl derivates, PCO)及蛋白与DNA交联率(DNA-protein crosslinks,DPC),借以说明Cd2+对精子生物大分子物质的氧化作用。为了进一步探索Cd2+对其精子形态的影响,在2个染毒时间(5 d、7 d),采用常规H.E.染色观察了精子的形态的变化,并结合透射电镜技术观察了染毒7 d后中浓度和高浓度组(Cd2+:29mg/L、116mg/L)精子超微结构的改变。为了进一步探究精子质量影响程度,运用流式细胞仪(flow cytometry, FCM)并结合特异性的荧光染料对华溪蟹精子的成活率、质膜完整性、顶体完整性及染色质结构进行了测定。结果显示:(1)急性Cd2+染毒导致河南华溪蟹的精子受到了严重的氧化损伤。由于Cd2+的富集,使ROS含量在3 d、5 d及7 d都有显著性增高,TAC在第7 d显著降低,导致MDA含量(5 d、7 d)、PCO含量(7 d)及DPC水平(3 d、7d)显著升高。(2)显微结构观察发现,急性Cd2+染毒可造成精子形态、顶体结构、细胞核形态的变化,且具有时间和浓度效应。亚显微结构观察显示,Cd2+染毒后,精子的细胞膜结构破坏,顶体结构变形,染色质异常化,且随着Cd2+浓度的增大,精子的受损程度加重。研究表明,急性Cd2+染毒造成了精子形态的损伤,并导致对其功能的影响。(3)精子的成活率随着所施加的Cd2+浓度的增大和染毒时间的延长而下降,质膜和顶体完整性降低,异染色质比例增大。在Cd2+浓度为58和116 mg/L,染毒5 d后,精子成活率出现显著降低;在Cd2+浓度为116 mg/L时,精子质膜和染色质结构均有明显损伤;而在Cd2+浓度为29 mg/L时顶体结构即出现显著损伤。在Cd2+浓度29、58、116 mg/L,染毒7 d后,精子成活率、质膜和顶体完整性下降;在所有染毒组中,华溪蟹精子的DNA结构受到了显著破坏。结果表明急性Cd2+染毒对河南华溪蟹精子质量有比较显著的损伤作用。结论:(1)在急性Cd2+的胁迫下,精子产生了过多的ROS,而随着其总抗氧化能力的下降,由ROS攻击精子中主要大分子物质,使其脂质、蛋白质和DNA均受到氧化损伤,最终导致精子处于氧化胁迫的状态。(2)在受到急性Cd2+所引起的氧化胁迫下,精子的细胞结构也发生了变化,精子的膜结构及细胞器均受到了比较严重的损伤,其细胞膜和顶体的结构均不再完整,而细胞核内染色质出现了凝集的现象,异染色质比例增大。(3)氧化损伤引起的形态结构的变化,也影响了精子质量,精子成活率显著下降,细胞膜和顶体膜的损伤程度加大,单链DNA所占的比例也明显上升,遗传物质的结构受到了破坏,精子质量下降。
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