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大刺鳅（Mastacembelus armatus）隶属合鳃目（Symbranchiformes）、刺鳅科（Mastacembelidae）、刺鳅属（Mastacembelus）,是一种广泛分布在印度、巴基斯坦、尼泊尔、西非、中国南方和东南亚其他地区的名贵经济鱼类。近年来,随着人工繁殖和养殖技术的发展,逐渐发现大刺鳅具有明显的性别二态性,且人工养殖过程中出现了性别比例失调等问题,大刺鳅的性别决定机制目前尚不清晰,严重影响了该物种的规模化繁育效率。本研究应用新的试验技术分别从基因组、转录组、细胞学和组织形态学等不同层面开展了性腺发育及其生理机制研究,为揭示大刺鳅性别决定机制提供了理论依据。本研究首先采取组织切片和形态学分析等手段,跟踪了人工养殖大刺鳅的性别分化过程并建立了性别判别模型;其次,采用简化基因组（2b-RAD-seq）技术,筛选大刺鳅性别特异片段,并建立性别特异SNP分子标记方法;然后,采用第三代基因组测序和组装技术完成了大刺鳅单倍体基因组组装、注释和分析,并针对性别连锁区域（SLR）的性别决定（SD）基因及异染色质化现象进行了研究;最后,采用RNA-seq、scRNA-seq、原位杂交、基因克隆及荧光定量分析等试验方法对性别连锁区域的性别决定基因进行分析与验证,结果如下:（1）本研究对不同性腺发育阶段的大刺鳅外部形态特征和性腺组织形态学进行跟踪、比较和分析,发现了人工养殖大刺鳅的间性群体;同时,通过采集300尾2龄雄性、雌性和间性人工养殖大刺鳅的18个外部形态特征和15个标准化形态性状,构建了三种形态性别的大刺鳅判别模型,其综合判别准确率达到97.0%,准确率提升1.4倍,为大刺鳅的养殖生产提供了一种简便且高效的性别判别技术。（2）本研究通过2b-RAD测序和PCR扩增验证,获得了2个雄性特异2b-RAD标签和2个SNPs。根据基因组数据库（GCF＿900324485.2）对2个2b-RAD标记的X-特异序列和Y-特异序列进行比较分析,鉴定出了2个雌性特异缺失片段（281 bp和4938 bp）和1个雄性特异缺失片段（156 bp）。根据这些缺失片段设计了Y-specific和XY-shared两组引物,以辨别大刺鳅的遗传性别。这些引物的特异性在全同胞家系F1代的81尾鱼中得到了验证。此外,本试验还设计了两对雄性特异SNP引物,它们只在雄鱼中特异性地扩增出一条条带。以上结果表明,大刺鳅属于雄性异配XY性别决定型。筛选的雄性特异标记鉴定结果准确,通用性好,可作为今后全雄育种的辅助工具。（3）本研究采用第三代HiFi测序技术和Hi-C辅助组装技术,完成了野生雄性大刺鳅的测序、单倍体拆分组装、注释和分析等。（1）获得HiFi数据39G,HiFi Reads的平均长度为13.34Kb,错误率仅为0.089%,平均覆盖率为99.6%。将分型出来的HiFi reads组装成2个单倍体contig版本基因组（hap-X和hap-Y）,hap-X和hap-Y基因组大小分别为582.0Mb和585.6Mb,与二倍型基因组大小（595.7Mb）相近。相比之下,hap-Y基因组的装置质量更好,其24条染色体上的Gap大多数少于10个,平均Gap数目为5.5,而hap-X基因组平均Gap为6.4。因此,本研究选择hap-Y基因组为研究对象,其注释基因总计22069个;（2）将大刺鳅单倍体基因组与其他7个物种的基因组数据进行全基因组比对分析,结果显示大刺鳅与黄鳝（Monopterus albus）亲缘关系最近,两者的分化时间预估为3.6千万年之间;（3）染色体形态学观察及核型分析结果显示,大刺鳅为2倍体（2n=48）,拥有中部着丝粒染色体（Metacentric Chromosome）5对,亚中部着丝粒染色体（Submetacentric Chromosome）3对,端部着丝粒染色体（Telocentric Chromosome）16对;（4）从重复序列的注释中发现了Cen-524（524bp）和Tel-190（190bp）2个卫星序列,通过FISH原位杂交试验,进一步确定了Cen-524为染色体着丝粒序列,Tel-190为染色体端粒序列;（5）在Y染色体上发现了7Mb的性别连锁区（SLR）,该区域包含了18738个雄性特异性SNP,并根据SNP的分布情况将SLR分为R1和R2两个区域,其中R1的重复序列比例为20%,R2为50%。CUT＆Tag试验结果显示,R1和R2之间H3K9me3修饰和广泛分布的染色体活性组分上也存在显著差异,这种分布不均衡现象也叫染色体异染色质化现象（heterochromatin）,其中R1区域为近着丝粒异染色质,驱动基因组上SLR的分化;（6）挖掘到syce3和hmgn6两个性别决定的候选基因,其中syce3基因在精巢中特异性高表达,hmgn6则在精巢和间性性腺中高表达;（7）发现大刺鳅X和Y型性染色体存在大范围的异染色质分化情况,异染色质区域主要集中在中心粒周围,其长度约为4.0Mb,而且该区域具有很低的重组率。（4）本研究从大刺鳅性腺RNA-seq检测数据中筛选出的一个新的性别决定候选基因dmrtb1,并通过基因克隆、荧光定量分析、原位杂交等试验进一步验证和分析了dmrtb1的基因结构和表达情况。获得dmrtb1全长转录本1194 bp,其中有开放阅读框870 bp,编码氨基酸289个。其DM结构域与DMRT家族其他基因相比,序列相似性＜45%。dmrtb1特异性表达于精巢生精小叶中,主要精巢的不同细胞中表达,而卵巢中没有表达。scRNA-seq的细胞分型结果显示精母细胞和卵母细胞的标记基因都在相同的间性性腺细胞群中富集,进一步证明了该细胞群具有双向性别分化的潜力。dmrtb1的表达时间与性腺发育相关,表明dmrtb1在大刺鳅的性别分化过程中起到了重要作用。