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目的NF-κB信号通路是能够使细胞产生炎症效应的一条重要通路。当伤寒沙门菌感染巨噬细胞时,能够通过自身脂多糖、鞭毛素等物质激活NF-κB信号通路,产生炎症因子,诱发各种炎症反应。Ⅵ型分泌系统是极为重要的分泌系统,它可以通过分泌效应蛋白对细菌在细胞内的生存和致病起重要作用。本实验室前期转录组提示伤寒沙门菌感染巨噬细胞能够引起NF-κB信号通路相关基因的m RNA水平变化。本研究将在前期的转录组结果上加以验证,并进一步探究伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统与NF-κB信号通路之间的关系及机制,这对于了解伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统影响巨噬细胞NF-κB信号通路以及炎症等方面有重要作用。方法1.伤寒沙门菌感染巨噬细胞转录组分析分别将2 h,24 h转录组与0 h比较,挑选出具有统计学差异的基因,对这些基因的功能进行分类及分析。2.转录组分析NF-κB信号通路相关结果验证通过检测伤寒沙门菌感染巨噬细胞2 h和24 h后NF-κB通路关键基因及蛋白的表达水平,验证巨噬细胞转录组结果。（1）THP-1细胞培养与诱导:实验前使用牛鲍技术板计数细胞,将细胞稀释后密度达到5×10~5个/m L,使用佛波乙酯（PMA）诱导48 h后进行巨噬细胞感染实验。（2）细胞感染实验:使用伤寒沙门菌野生株进行细胞感染试验。以加入庆大霉素作用1 h后的时间点作为起始时间点,感染2 h和24 h后提取巨噬细胞总RNA和细胞总蛋白。3.伤寒沙门菌感染巨噬细胞早期对NF-κB信号通路的影响检测并分析伤寒沙门菌感染巨噬细胞早期（包括2 h、4 h、6 h和短时间5 min、15min、30 min）后NF-κB信号通路变化趋势。对于伤寒沙门菌感染巨噬细胞短时间0-30 min试验,无需加入庆大霉素,加入细菌感染至相应时间直接提取巨噬细胞总RNA或细胞总蛋白。4.伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统对巨噬细胞对NF-κB信号通路的影响检测并探讨Ⅵ型分泌系统结构基因sciS缺陷株和sciK基因高表达菌株感染巨噬细胞后NF-κB信号通路变化趋势。（1）ΔsciS:使用WT-p E、ΔsciS-p E以及C-ΔsciS菌株进行巨噬细胞感染实验,培养2h、6 h、12 h和24 h时间后提取巨噬细胞RNA或细胞总蛋白。（2）sciK基因高表达菌株:使用WT-p BAD/g III和WT-psciK菌株进行巨噬细胞感染实验,培养2 h、6 h、12 h和24 h时间后提取巨噬细胞RNA或细胞总蛋白。5.Ⅵ型分泌系统影响NF-κB信号通路介导的下游炎症因子的表达（1）使用q RT-PCR检测Ⅵ型分泌系统sciS缺陷株和sciK基因高表达菌株感染巨噬细胞后炎症因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）的表达变化。（2）使用染色质免疫共沉淀（Ch IP）-qPCR技术:采用Ch IP技术获取sciS缺陷株和sciK基因高表达菌株分别感染巨噬细胞12 h和6 h后,NF-κB复合物（p65-p50）入核与NFKBIZ抑制蛋白结合后p65结合的下游靶DNA,然后用qPCR技术定量检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。结果1.转录组数据分析NF-κB信号通路的经典途径的相关基因p50、p65以及非经典途径的p52、rel B等基因都在巨噬细胞感染的2 h或24 h显著上调,而编码NF-κB信号通路负调控因子的基因如Nfkbiz、Tnfaip3、Cyld、Tnip1、Tnip3、Traf1以及Zc3h12a的转录水平也在感染2 h或24 h上调。2.转录组分析NF-κB信号通路相关结果验证q RT-PCR分析经典途径p50、p65以及非经典途径的p52、rel B等基因和编码NF-κB信号通路负调控因子的基因如Nfkbiz、Tnfaip3、Cyld、Tnip1、Tnip3、Traf1以及Zc3h12a与转录组结果趋势总体一致。3.伤寒沙门菌感染巨噬细胞早期对NF-κB信号通路的影响（1）0-30 min:q RT-PCR结果提示NF-κB相关基因的m RNA水平在伤寒沙门菌感染巨噬细胞30 min时均上调,如Nfkbiz、Tnfaip3、Cyld、Tnip1、Tnip3、Traf1,但p50的表达无明显变化。（2）0-6 h:NF-κB信号通路经典途径的p50基因感染2 h-6 h后m RNA水平上调,非经典途径的变化趋势与经典途径一致,且经典途径的抑制蛋白NFKBIZ的表达在感染后2h、4 h以及6 h上调,编码非特异性抑制因子的基因Tnfaip3、Cyld、Tnip1、Tnip3、Traf1感染后均上调。4.伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统对巨噬细胞NF-κB信号通路的影响（1）sciS基因:q RT-PCR结果显示,当ΔsciS感染巨噬细胞前期2 h和后期24 h时,p50表达水平相对于WT有所下调,6 h和12 h无明显差异。Western blot结果显示,ΔsciS感染巨噬细胞2 h经典途径关键蛋白p65磷酸化水平较WT下调,6 h、12 h和24 h相比于WT明显上调,非经典途径的关键蛋白p100的剪切产物p52和Rel B在感染后12 h及24 h表达上调。NF-κB信号通路抑制因子NFKBIZ的m RNA水平在2 h、6 h、12 h及24 h均下调,其蛋白表达水平无明显差异,而该通路共同途径的抑制因子TNIP1和CYLD m RNA水平在12 h和24 h均上调。（2）sciK基因:q RT-PCR结果表明,sciK高表达菌株与WT相比,感染巨噬细胞后,经典途径的关键基因p50在2 h-24 h均上调。Western blot结果显示,p65蛋白的磷酸化水平在感染后6 h、24 h明显增高,其特异性抑制因子NFKBIZ m RNA表达水平和蛋白表达水平在6 h和24 h表达也相应上调。非经典途径的主要蛋白p52以及在感染后12 h和24 h显著上调,Rel B蛋白在感染后24 h表达水平显著上调。非特异性抑制因子CYLD m RNA表达水平在感染后2 h和6 h表达上调,TNIP1在感染2 h-24 h均上调。5.Ⅵ型分泌系统影响NF-κB信号通路介导的下游促炎因子的表达（1）q RT-PCR:ΔsciS-p BAD33相比WT-p BAD33,感染巨噬细胞6 h后,TNF-α的m RNA表达水平显著上调,但12 h表达水平下调,IL-1β在感染中后期表达均上调,IL-6在感染后期表达上调。WT-psciK相比WT-p BAD/g III,IL-6的表达水平在感染后2 h-24 h均上调,TNF-α和IL-1β感染后2 h表达上调,TNF-α在感染后6 h及24 h下调,12 h无明显差异,IL-1β6 h下调,12 h和24 h表达无差异。（2）Ch IP-qPCR:ΔsciS相比WT,感染6 h后NF-κB与TNF-α基因启动子的结合被抑制,与IL-1β和IL-6的结合升高。sciK高表达菌株在感染后12 h能够抑制NF-κB与TNF-α和IL-1β基因启动子的结合,促进与IL-6基因启动子的结合。结论1.伤寒沙门菌感染巨噬细胞能够激活NF-κB信号通路,但同时也能激活通路相关抑制因子的表达。2.伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统结构基因sciS基因可以刺激巨噬细胞被感染2 h后NF-κB信号通路经典途径和非经典途径的表达,但是在感染后6 h、12 h和24 h该通路会被抑制。3.Ch IP-qPCR结果提示,sciS基因能够对由经典途径诱导的炎症因子的表达起到特异性抑制作用,即感染6 h后NF-κB与TNF-α启动子的结合被抑制,与IL-1β和IL-6的结合升高。4.sciK能够诱导NF-κB信号通路表达上调,其中经典途径在感染后6 h和24 h的表达明显增高,其特异性抑制蛋白NFKBIZ表达水平也相应上调,很有可能在p65-p50复合物激活入核后,NFKBIZ上调发挥抑制作用。5.Ch IP-qPCR结果提示,sciK能够抑制NF-κB与NFKBIZ结合后对p65-p50转录因子与TNF-α和IL-1β启动子的结合,而与IL-6启动子的结合在感染6 h后上调。此外,sciK能够增强巨噬细胞被感染后12 h和24 h非经典途径的表达。