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文章主要从以下几部分进行论述： 第一部分 年轻血浆改善血管内皮细胞衰老表型 目的： 血管内皮细胞衰老伴随增龄出现，在血管衰老及增龄相关性血管疾病的发生与发展中起重要作用。联体动物实验证实，年轻血浆能够逆转老年小鼠多重增龄性改变，让年老小鼠呈现年轻化改变。然而年轻血浆对血管内皮细胞衰老的作用还尚无报道。本研究拟探究年轻血浆对血管内皮细胞衰老表型的影响。 方法： 经Ⅱ型胶原酶消化分离的原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC:Humanumbilical vein endothelial cells），通过连续培养传代方法构建细胞复制性衰老模型。选取相对健康年轻男性（15-30岁）及老年前期男性（45-60岁）志愿者，于清晨收取空腹血浆，并各自取等体积血浆混匀后备用。将衰老血管内皮细胞预先用含20%老年前期血浆（PEP:pre-elderly plasma）培养基处理48h，将处理后的细胞经消化一分为二，一组继续用含PEP培养基培养，另一组换用含20%年轻血浆培养基（YP:Young plasma）培养。血浆干预持续5天，期间每48小时更换一次培养基。通过检测血管生成、伤口愈合、衰老相关半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、PCR及Western blot检测衰老相关基因SIRT1、P53，P21，P16RNA及蛋白水平来评估血管内皮细胞功能及衰老状态。 结果： 经vWF（von Willebrand factor）因子鉴定，经II型胶原酶消化分离的细胞为HUVEC且细胞纯度达95%以上，能用于后续实验。血管内皮细胞经连续传代培养至群体倍增指数（PDL:Population doubling level）28，呈现细胞衰老状态，表现为随PDLs增加，细胞增殖能力降低并趋于平稳，细胞群体倍增时间延长。衰老相关半乳糖苷酶染色比例升高（PDL2854.3%±6.0%vsPDL813.3%±3.1%,p＜0.05）。SIRT1RNA及蛋白表达水平降低，P53、P21RNA及蛋白表达水平升高。 与PEP干预组对比，YP干预5天能够改善血管内皮细胞衰老表型，表现为小管生成能力增加(80.0±14.8in YPvs38.8±21.3in PEP,p＜0.05),伤口愈合能力增加（65.4%±1.2%in YPvs44.1%±8.0%in PEP,p＜0.05,伴随着衰老相关半乳糖苷酶染色降低（58.2%±7.9%in YPvs74.8%±5.0%in PEP,p＜0.05）及细胞周期相关蛋白分子的表达降低。 结论： 血管内皮细胞经过连续传代至PDL28，呈现出衰老表型，由此构建的复制性衰老细胞模型能够用于后续的相关研究。年轻血浆干预能够改善血管内皮细胞衰老表型，表现为增加其血管生成及伤口愈合能力，降低衰老相关半乳糖苷酶染色比例，降低细胞周期相关蛋白分子的表达，其中的具体机制有待进一步探讨。 第二部分 年轻血浆改善血管内皮细胞衰老表型机制探究 目的： 细胞衰老是一个主要受基因和环境因素影响的复杂生物学过程。血管内皮细胞由于其独特的解剖学位置，血液因素对其衰老具有重要影响。我们前期研究发现，年轻血浆干预能够改善衰老血管内皮细胞的表型，但其中的具体机制还有待探究，明确。本研究拟借助RNA-sequence技术寻找衰老HUVECs上受年轻血浆干预影响的基因，并借助基因敲低技术证实其在血管内皮细胞衰老过程中的作用，继而构建相应的信号通路。 方法： 3根独立来源的人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）用于实验，分别培养至PDL28，然后利用含20%老年前期血浆（PEP）培养基预处理48h，再经过消化一分为二，一部分继续用含20%PEP培养基处理，另一部分换用含20%YP培养基继续处理48小时。提取RNA并利用Illumulia Hiseq2000平台进行RNA-sequence，检测HUVECs上受YP干预影响的基因。将至少一个样本中基因RPKM≥2作为基因有一定表达量，Fold Change≥1.25作为有差异化评判标准。利用RT-PCR技术对测序结果进行验证，并检测测序所得差异化表达基因在HUVECs复制性衰老过程中表达改变情况，挑选出可能参与血管内皮细胞衰老的基因，并用siRNA沉默技术加以验证。 结果： 三组测序数据进行分组配对分析，获得36个在三组数据中均具有差异化表达的基因，表现为年轻血浆诱导20个基因上调，16个基因下调。36个差异化表达基因中有14个基因在HUVECs复制性衰老过程中有差异化表达改变，其中DHCR24、MCM10、ACAT2、WBP1、INO80B、CYP26B1、UNC5B共7个基因，年轻血浆干预能够逆转其在复制性衰老过程中表达趋势。在年轻血管内皮细胞上单独沉默DHCR24、MCM10加速其衰老进程；而单独沉默UNC5B、CYP26B1、WBP1则可一定程度抑制其衰老状态；单独沉默ACAT2、INO80B对细胞衰老无明显改变。 结论： 研究发现DHCR24、MCM10为抗衰老基因，UNC5B、CYP26B1、WBP1为促衰老基因，ACAT2、INO80B则可能仅伴随细胞衰老过程发生改变但不参与细胞衰老过程的调节。年轻血浆可能通过升高DHCR24、MCM10的表达，以及降低UNC5B、CYP26B1、WBP1的表达，进而调节细胞增殖、迁移、血管生成能力；改善细胞周期、DNA损伤、炎症水平、氧化应激、凋亡等生物学过程来改善衰老血管内皮细胞表型。