第一部分Anti-HER2 Fab’修饰的包裹PE38KDEL的PLGA靶向纳米颗粒(PE-NP-HER)的制备和表征 1、PE38KDEL毒素和Anti-HER2 Fab’制备利用原核系统表达和镍柱亲和层析纯化得到了纯度超过95％的PE38KDEL，rhuMAbHER2经过木瓜蛋白酶酶切后得到了了纯度超过95％的Anti-HER2 Fab’片段。 2、PE38KDEL毒素的生物活性由于PLGA纳米颗粒的制备过程包括有机溶剂和超声的处理，这些制备方法可能会影响PE38KDEL的完整性和活性，荧光素酶蛋白体外翻译实验结果证实PE38KDEL的活性在经过PLGA包裹以后得到绝大部分保留。 3、纳米表征通过复乳溶剂挥发法制备得到了包裹PE38KDEL的PLGA纳米颗粒(PE-NP)，然后利用碳化二亚胺法将Anti-HER2 Fab连接在PE-NP-表面制备得到了PE-NP-HER靶向纳米颗粒。结果显示：PE-NP和PE-NP-HER的平均粒径分别为108.3±13.9 nm和124.2±21.2 nm(mean±SD；n=10)，透射电镜证实纳米颗粒外形圆整，大小均一，PE-NP的包裹效率为41.9±2.3％(mean±SD，n=4)，载药量为8.5±0.2μg/mg(mean±SD，n=4)，PE-NP-HER的抗体连接效率为19.4±2.4μg/mg(mean±SD，n=4)，PE-NP和PE-NP-HER的zeta电位分别为-36±5 mV and12±7mV(mean±SD；n=10)。 4、体外释放实验PE-NP的体外释放具有规律性，初期有16.6％的突释，24 h累计释放量达28.3％，在96h达到50％。 第二部分靶向纳米颗粒的体内外抗肿瘤活性 1、靶向纳米颗粒的竞争抑制试验PE-NP-HER和PE-HER(PE38KDEL和rhuMAbHER2的化学偶联物)均能竞争rhuMAbHER2与高表达HER2的D2F2/E2细胞的结合，而且PE-NP-HER的竞争能力较PE-HER强。 2、靶向纳米颗粒的内吞共聚焦显微镜证实PE-NP-HER能特异性结合D2F2/E2细胞并被其内吞，而非靶向的PE-NP或PE-NP-anti-CD25和D2F2/E2细胞的结合和内吞很弱。 3、靶向纳米颗粒的体外细胞毒性体外细胞杀伤实验证实PE-NP-HER对高表达HER2的乳腺癌细胞株具有特异性的杀伤活性，而HER2表达阴性的乳腺癌细胞株的杀伤活性较弱。 4、靶向纳米颗粒的半数致死剂量LD50和肝毒性对小鼠来说，PE-NP-HER的LD50为6.8mg/kg，大大超过PE-HER和PE38KDEL的LD50(2.2mg/kg)。对小鼠静脉注射PE-HER和PE38KDEL后，ALT(反应肝脏损伤的指标)和注射之前比有急剧的上升，然而在注射PE-NP-HER纳米颗粒后，ALT变化不大。 5、靶向纳米颗粒的免疫原性和体外避免中和性抗体中和的研究和PE38KDEL和PE-HER相比，PE-NP和PE-NP-HER的免疫原性大大减小。体外避免中和性抗体中和的研究证实PE-NP-HER的细胞毒作用不受抗PE38KDEL中和性抗体的影响。 6、靶向纳米颗粒的的体内抗肿瘤活性小鼠体内抗肿瘤实验证实PE-HER和PE-NP-HER均以剂量依赖性的方式抑制了肿瘤生长，并且PE-NP-HER的抗肿瘤活性优于PE-HER和其他对照组。 7、靶向纳米颗粒的在预免疫小鼠体内的抗肿瘤活性在预免疫PE38KDEL和PE-NP的小鼠中进行了相似的抗肿瘤实验。在抗PE38KDEL中和性抗体存在的情况下，PE-NP-HER仍然显示出良好的抗肿瘤活性，而PE-HER的抗肿瘤活性大大下降。 第三部分 Anti-HER2 Fab修饰的包裹PE38KDEL的PEG化免疫脂质体(PE-HER-liposomes)的制备和表征 1、纳米表征PE-HER-Liposomes的平均粒径为194.47±3.2 nm，包封率为90.49±6.39％，载药量为10.17±1.39μg/mg，连接在PE-HER-Liposomes上的Anti-HER2 Fab’的量为27.83±3.13μg/mg磷脂，抗体的连接效率为66.94±4.43％(mean±SD；n=3)。 2、脂质体的体外释放实验普通脂质体的PE38KDEL的释放速率远大于PEG化脂质体的释放速率，表明PEG化的脂质体显示出较慢释放速率并能满足作为有效药物传递系统的需要。 第四部分免疫脂质体的体外抗肿瘤活性研究 1、体外细胞结合活性流式细胞术证实PE-HER-liposomes能特异性靶向HER2高表达的SK-BR3细胞。共聚焦显微镜结果显示PE-HER-liposomes能明显被SK-BR3细胞特异性内吞。 2、体外细胞毒性PE-HER-liposomes对HER2高表达的SK-BR3细胞的毒性最大，对HER2中度表达的MDA-MB-231细胞的毒性次之，而对HER2表达阴性的MCF-7细胞的毒性最小。PE-HER-liposomes对SK-BR3细胞的细胞毒性较PE-HER大，在MDA-MB-231细胞中也得到了相似的结论。 第五部分介导基因转运的DC-chol/DOPE阳离子脂质体的制备与表征 1、阳离子脂质体/pDNA复合物粒径和zeta电位的测定DC-chol/DOPE脂质体在复合质粒DNA(pDNA)后，粒径的变化呈先递增后减小的趋势。随着脂质体中PEG含量的增加，脂质体粒径变化幅度越来越小。对于不同DC-chol/DOPE摩尔比的脂质体而言，DC-chol含量越高的脂质体的zeta电位越高，PEG含量越高的脂质体的zeta电位变化幅度越小，和0mV越接近。 2、阳离子脂质体/siRNA复合物粒径和zeta电位的测定DC-chol/DOPE脂质体在复合siRNA后，粒径、zeta电位的变化趋势和阳离子脂质体/pDNA变化趋势一致。 3、凝胶阻滞实验当DC-chol/pDNA的质量比≥2：1时，pDNA完全被凝胶阻滞住。对于DC-chol含量较低的脂质体来讲，当DC-chol/siRNA的质量比为7.5，10，15时，脂质体能完全包裹siRNA。随着PEG含量的增加，siRNA的包封能力大大降低。 4、超滤离心法检测siRNA的包封率DC-chol/siRNA的质量比越大，siRNA的包封率越高。然而，PEG化对siRNA的包封率有负面影响。 5、DNasel酶切实验当pDNA和脂质体形成脂质体/pDNA复合物后，DNaseI对pDNA的降解作用减弱，PEG含量越高的DC-chol/DOPE脂质体对pDNA的保护作用越弱。 6、siRNA的血清稳定性实验DC-chol/DOPE脂质体能显著增加siRNA的血清稳定性。 7、pDNA转染当DC-chol/DOPE的摩尔比为1/2时，脂质体的转染效率最高。当DC-chol/pDNA的质量比为3/1时，转染效率最高。随着DC-chol/pDNA的质量比逐渐增加，pDNA转染效率逐渐递减。PEG化能显著降低脂质体的转染效率。 8、siRNA转染在DC-chol/DOPE的摩尔比为1/1时，脂质体的转染效率最高。对于不同配比的DC-chol/DOPE脂质体来说，无血清转染效率要高于有血清转染效率。 9、siRNA转染的基因沉默效率siRNA的基因沉默效率和siRNA的转染效率呈正比。 第六部分 Anti-HER2 Fab修饰的DC-chol/DOPE靶向阳离子脂质体(HER2-Flip)的制备和靶向性研究 1、HER2．Flip的体外靶向性HER2-Flip和Lip(无靶向性的DC-chol/DOPE阳离子脂质体)的荧光结合强度随着脂质体的浓度上升而上升，然而Lip的荧光结合强度显著弱于HER2-Flip。Anti-HER2 Fab’能剂量依赖性的抑制HER2-Flip与SK-BR3细胞的结合，而对Lip和SK-BR3细胞结合没有任何作用。 2、HER2-Flip-FAM-siRNA的体外靶向性HER2-Flip-FAM-siRNA(HER2-Flip和FAM-siRNA的复合物)的荧光结合强度随着脂质体的浓度上升而上升，然而Lip-FAM-siRNA(Lip和FAM-siRNA的复合物)的荧光结合强度显著弱于HER2-Flip-FAM-siRNA。Anti-HER2 Fab’能剂量依赖性的抑制HER2-Flip-FAM-siRNA与SK-BR3细胞的结合，而对Lip-FAM-siRNA和SK-BR3细胞结合没有任何作用。 3、共聚焦实验HER2-Flip-cy3-siRNA能被SK-BR3细胞特异性的大量内吞，而Anti-HER2 Fab’能大大减少HER2-Flip-cy3-siRNA的特异性内吞。SK-BR3细胞对于非靶向的Lip-cy3-siRNA的内吞较少。 实验结论： HER2抗原特异性的抗体靶向纳米颗粒的克服了蛋白药物的非特异毒性和免疫原性，解决了基因药物的运输载体问题。尤为重要的是，抗体靶向纳米颗粒能特异性靶向HER2高表达的乳腺癌细胞并具有细胞杀伤活性或特异性基因沉默效率，可能作为一种临床治疗HER2高表达乳腺癌的有效新方法。