背景近年来,非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的发病率日益升高并且逐步发展成为最常见的慢性肝病。但是目前导致肝脏脂肪变性发生及其向严重肝脏疾病转变的具体机制仍然没有完全阐明,从而限制了NAFLD的药物靶标及可用于设计有效治疗策略的生物标志物的发现。因此,深入研究NAFLD肝脏脂质沉积的调控机制对NAFLD的早期防治有着重要意义。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MST1(mammalian Ste20-like kinase 1,STK4)是哺乳动物STE20相关激酶,其高度保守并且广泛存在于各种组织中。过去对MST1的研究主要集中于其在细胞调控、肿瘤生成以及器官大小控制等方面,而近几年对MST蛋白激酶家族的研究集中于其与代谢调节的关系,尤其是与肝脏代谢调节的关系。部分文献及本课题组前期研究均证实MST1对肝脏脂代谢具有重要的调控效应,并且能够作为NAFLD治疗的一个新靶点。那么靶向肝脏MST1表达的调控手段有可能成为NAFLD有效的疾病干预方式。调控手段有肝脏源性和外源性两种途径。而随着脂肪组织作为经典的内分泌器官,其在维持肝脏脂质代谢稳态中同样具有重要作用。因此我们关注于脂肪组织中是否存在其他脂源性分子靶向肝脏的调控方式?微小RNA(miRNAs)作为一类通过抑制相应的靶mRNA从而负调控基因表达的小RNA分子,已经成为调节新陈代谢的关键分子。研究发现miRNAs不仅可以在自身合成细胞中发挥生物学功能,还可以分泌到循环系统中,进入其他组织调节受体细胞的生物学功能。而miRNAs进入循环系统中的主要存在形式是被包裹在微囊泡中,外泌体(exosomes)作为一类天然脂质纳米级微囊泡,能够稳定地将其内容物运送到相邻或远距离的细胞,从而进一步修饰靶细胞的基因表达、信号传导和整体功能。因此,探究脂肪源性的miRNAs借助外泌体中转,进而对肝脏脂质代谢靶基因发挥作用这一具体机制,可能成为肝脏脂质沉积调控的一个新研究途径。正如以上所阐述,肝脏是脂肪合成及储存的重要脏器,肝脏内脂肪酸合成与氧化分解的平衡是脂质代谢的重要机制,脂肪组织来源的循环miRNAs能否通过介导肝脏组织中MST1基因的表达,调节肝脏脂质代谢进而影响NAFLD的发生发展。对于这一问题的回答,将为肝脏与脂肪组织的代谢联系提供新的实验证据,并为NAFLD治疗提供新的方案和手段。目的1.探究MST1对肝脏脂质代谢的调节及其相关机制;2.筛选高脂背景下小鼠脂肪组织中差异性高表达并靶向肝脏MST1基因的miRNAs分子;3.探究外泌体是否能够携带特定脂源性miRNAs稳定输送到肝细胞内并且影响肝脏脂质代谢;4.探究特定的脂源性miRNAs调控肝脏脂质代谢的可能信号通路与机制。方法1.分别采用临床非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪肝病阴性对照(Non-NAFLD)病人肝脏组织样本,以及给予高脂饲料或标准饲料喂养12周的C57BL6/J小鼠肝脏组织样本,通过WB检测MST1、pAMPK/AMPK、pSREBP 1c/SREBP1c、pACC/ACC及FAS的蛋白表达水平,通过qPCR检测MST1的mRNA表达水平。2.MST1 shRNA慢病毒经尾静脉注射到NAFLD模型小鼠体内,利用HE染色及油红O染色方法分析肝细胞中的脂滴堆积状况;检测血清中TG、TC、HDL及LDL的含量判断肝脏中脂质水平;运用WB检测MST1、pAMPK/AMPK、pSREBP 1c/SREBP 1c、pACC/ACC及FAS的蛋白水平。采用MST1 shRNA质粒瞬时转染正常培养或棕榈酸(palmitic acid,PA)处理的AML-12小鼠肝细胞,通过油红O染色分析肝细胞内的脂滴状况;使用酶比色法进行肝细胞内甘油三酯含量的检测;使用WB检测MST1、pAMPK/AMPK、pSREBP 1c/SREBP1c、pACC/ACC及FAS的蛋白表达水平;采用qPCR检测相关基因MST1、SREBP 1c、ACC、FAS及CPT-1α的表达。3.MST1过表达慢病毒经尾静脉注射到NAFLD小鼠体内,利用HE染色及油红O染色方法分析肝细胞中的脂滴堆积状况;检测血清中TG、TC、HDL、LDL含量判断肝脏中脂质水平;运用WB检测MST1、pAMPK/AMPK、pSREBP 1c/SREBP 1c、pACC/ACC及FAS的表达。采用MST1过表达质粒转染正常培养或PA处理的AML-12细胞,通过油红O染色分析肝细胞内的脂滴状况;使用酶比色法进行肝细胞内甘油三酯含量的测定;运用WB检测MST1、pAMPK/AMPK、pSREBP1c/SREBP1c、pACC/ACC及FAS的表达;采用qPCR检测MST1、SREBP 1c、ACC、FAS及CPT-1α表达。4.C57BL6/J小鼠给予高脂肪饲料或标准饲料喂养12周。通过高通量RNA HiSeq/MiSeq测序分别筛选小鼠肝脏、脂肪组织及血清外泌体中靶向肝脏MST1基因的miRNAs分子;采用Real-time PCR检测miR-199a在上述组织中的表达变化;miR-199a mimics转染PA处理或未处理的AML-12细胞48 h,通过油红O染色方法判断肝细胞内的脂滴状况;使用酶比色法进行肝细胞内甘油三酯含量的检测。5.将miR-199a(XmiR-199a)或非靶向miR-NT(XmiR-NT)片段装载到XMIRXpress慢病毒载体上,随后转染到外泌体生产细胞(HEK293)中,通过差速超速离心获得含有miR-199a或miR-NT的外泌体,通过WB检测外泌体相关蛋白标记物CD9和CD63的表达;通过透射电子显微镜观察外泌体的形态特征。6.采用RFP标记的XPack质粒,转染外泌体生产细胞(HEK293)48 h,通过荧光显微镜观察HEK293细胞是否产生报告蛋白RFP以判断是否释放可供下游应用的外泌体;分离、纯化HEK293细胞培养液中的外泌体并添加到AML-12小鼠肝细胞中,通过荧光显微镜检测带有RFP标签蛋白的外泌体能否输送到靶细胞中;采用GFP标记的XMIRXpress慢病毒载体装载miR-199a并利用外泌体包装技术进行包裹,通过分离纯化获得含有miR-199a的外泌体(EXO-miR-199a),进而采用尾静脉注射方法将EXO-miR-199a注射到裸鼠体内,通过荧光发射断层扫描(FLECT)检测miR-199a在裸鼠体内的分布情况;运用RNA荧光原位杂交技术检测miR-199a在小鼠肝脏中的表达情况。7.采用2μg EXO-miR-199a或EXO-miR-NT干预正常或PA处理的AML-12细胞48 h,运用qPCR检测miR-199a的表达;通过油红O染色分析肝细胞内的脂滴状况;使用酶比色法进行肝细胞内甘油三酯含量的检测;运用双荧光素酶报告基因系统检测Mst13’UTR区活性;运用WB检测MST1、pAMPK/AMPK、pSREBP 1c/SREBP 1c、pACC/ACC及FAS的表达;采用qPCR检测MST1、SREBP 1c、ACC、FAS及CPT-1α的基因表达。8.采用30μg EXO-miR-199a或EXO-miR-NT经尾静脉注射高脂诱导的NAFLD模型小鼠体内,连续注射3周,每周注射一次并监测小鼠体重变化。计算肝湿重;通过对肝脏组织进行HE染色及油红O染色,分析肝组织中的脂滴状况;使用酶比色法进行肝细胞内甘油三酯含量的测定;利用WB检测MST1、pAMPK/AMPK、pSREBP 1c/SREBP1c、pACC/ACC及FAS的表达;采用qPCR检测MST1、SREBP 1c、ACC、FAS及CPT-1α的基因表达。结果1.脂代谢紊乱的肝组织内MST1基因及蛋白水平均明显降低NAFLD病人中MST1的蛋白及mRNA表达水平均明显低于Non-NAFLD病人组;NAFLD动物模型组MST1蛋白及mRNA表达水平均明显低于NCD动物模型组。2.MST1敲低加重肝脏脂质堆积现象NAFLD模型小鼠尾静脉注射MST1 shRNA慢病毒,HE染色法、油红O染色法及甘油三酯含量测定等结果显示,MST1 shRNA明显加重了肝组织脂肪堆积现象;WB结果显示,MST1 shRNA抑制了AMPK/SREBP 1c信号通路,进而增加了脂肪酸合成限速酶ACC及FAS的表达,加重了脂肪代谢紊乱。MST1 siRNA瞬时转染经PA干预的AML-12细胞48 h,油红O染色实验及甘油三酯测定结果显示,MST1敲低加重了肝脏脂肪堆积现象。3.MST1过表达时肝细胞内甘油三酯的合成明显减少小鼠尾静脉进行MST1过表达慢病毒的注射及细胞实验进行MST1过表达质粒瞬时转染,综合HE染色法、油红O染色法、甘油三酯含量测定等研究方法,结果显示,MST1过表达时肝细胞内的脂质代谢得到明显的改善,进而使得肝脏脂质堆积情况得以减轻。4.miR-199a-5p主要表达在脂肪组织并且能够加重肝脏脂质生成NAFLD动物模型组与NCD动物模型组分别进行肝脏、脂肪组织及血清外泌体取样,采用RNA HiSeq/MiSeq测序及qPCR实验证实特征性靶向肝脏MST1基因的miR-199a-5p在脂肪组织中高表达;油红O染色法和甘油三酯含量结果显示miR-199a-5p能够加重肝脏脂质堆积。5.外泌体能够包裹miR-199a-5p并且定向运输到肝脏组织WB结果显示转染EXO-miR-199a的HEK293细胞组,外泌体标志性蛋白CD9和CD63均高表达;透射电子显微镜结果显示差速超速离心法成功分离到直径为30-100 nm的双层膜结构的外泌体;荧光显微镜结果显示带有RFP蛋白的外泌体成功输送到了靶细胞AML-12;裸鼠体内荧光发射断层扫描(FLECT)结果和RNA荧光原位杂交结果显示EXO-miR-199a多集中于肝脏组织,并且稳定高表达于肝脏组织中。6.EXO-miR-199a通过靶向抑制肝脏MST1加重肝脏脂质堆积2μg EXO-miR-199a或EXO-miR-NT干预AML-12细胞48 h,qPCR结果显示EXO-miR-199a组miR-199a的表达量明显高于EXO-miR-NT组;油红O染色和甘油三酯含量测定结果显示EXO-miR-199a组肝细胞脂滴堆积明显增多;2μg EXO-miR-199a或EXO-miR-NT干预正常或PA处理的AML-12细胞48 h,双荧光素酶报告基因结果显示EXO-miR-199a组MST1 3’UTR区荧光素酶活性明显低于EXO-miR-NT组,结果表明miR-199a能够直接靶向抑制MST1 mRNA水平;WB结果显示,EXO-miR-199a组MST1、pAMPK、pSREBP 1c和pACC的表达均受到抑制,而FAS的表达明显增加;qPCR结果显示,EXO-miR-199a明显增加了脂质合成相关限速酶ACC及FAS等的表达,而抑制脂肪酸氧化酶CPT-1α的表达。7.EXO-miR-199a可在体内通过抑制MST1/AMPK/SREBP-1c通路加重NAFLD30μg EXO-miR-199a或EXO-miR-NT经尾静脉注射到高脂喂养的NAFLD模型小鼠体内,一周注射一次连续注射3周,结果显示EXO-miR-199a组小鼠的体重以及肝湿重水平明显增加;HE染色及油红O染色结果显示,EXO-miR-199a组肝脏内脂滴的生成较EXO-miR-NT明显增多;小鼠血清和肝组织的甘油三酯检测结果显示,EXO-miR-199a组加重了高脂诱导的脂质异常;肝组织WB结果显示,EXO-miR-199a抑制了MST1、pAMPK、pSREBP 1c及pACC的表达,而增加了FAS的表达;qPCR结果显示,EXO-miR-199a明显增加了脂质合成酶的表达,而抑制了脂肪酸氧化酶的表达。结论1.MST1通过AMPK/SREBP1 c通路调控肝脏脂质代谢,缓解肝脏脂质堆积;2.小鼠脂肪组织特征性高表达miR-199a-5p并且能够通过外分泌作用调控肝脏脂代谢;3.外泌体携带miR-199a-5p能够输送到肝细胞内并促进肝脏脂质生成;4.miR-199a-5p通过调控MST/AMPK/SREBP-1c通路影响肝脏的脂质合成与分解。