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本研究利用猪抗菌肽PMAP-23的氨基酸片段,应用杂交瘤技术成功制备了抗天然抗菌肽PMAP-23单克隆抗体。然后利用制备的单克隆抗体建立抑制酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,在翻译水平上研究了乳铁蛋白对猪抗菌肽PMAP-23基因分泌表达的影响。主要研究结果如下:
1.利用碳化二亚胺法将人工合成的PMAP-23(RIIDLLWRVRRPQKPKFVTVWVR)的氨基酸片段与卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶联制备人工免疫原PMAP-23-OVA和包被原PMAP-23-BSA,应用杂交瘤技术成功制备了两株能稳定分泌PMAP-23单克隆抗体的杂交瘤细胞株2E4和3C1。将获得的阳性杂交瘤细胞株扩大培养,通过腹腔注射注入BALB/C小鼠体内,制备PMAP-23的单克隆抗体腹水,并应用辛酸-硫酸铵盐析法纯化腹水得到纯度较高的单克隆抗体。
2.对纯化的单克隆抗体进行相关性质初步鉴定。试验结果发现,骨髓细胞培养上清对PMAP-23单克隆抗体具有明显的抑制效果,说明PMAP-23是猪骨髓源性抗菌肽,且制备的PMAP-23单克隆抗体是天然抗菌肽PMAP-23的单克隆抗体;所得单克隆抗体浓度高于10.0 mg/mL;间接ELISA测定其效价在1:2.5×105以上;其中2E4细胞株分泌的单克隆抗体效价更高,其最佳工作浓度为稀释4.1×105倍;制备的单克隆抗体特异性强,与其他抗菌肽无交叉反应;双向琼脂扩散试验测得制备的单克隆抗体为IgG1亚类。
3.本试验利用制备的抗菌肽PMAP-23单克隆抗体和杂交瘤技术筛选并建立了3株能分泌抗菌肽PMAP-23的细胞株,分别命名为1E7、282和285。该细胞株培养上清中抗菌肽PMAP-23的含量与对照组小鼠骨髓瘤细胞培养上清中抗菌肽含量相比,差异均极显著(P＜0.01)。该细胞株的建立为抗菌肽PMAP-23相关性质的研究奠定了基础。同时,本试验的研究方法和思路也为其他小分子肽类物质的研究奠定了基础。
4.从30日龄断奶杜长大仔猪的股骨抽取并分离骨髓细胞,进行体外培养。细胞培养48 h后,分别以10μg/mL、100μg/mL、1000μg/mL的乳铁蛋白处理细胞,空白对照孔用等量的RPMI1640培养液代替,继续培养3 h,6 h,12 h和24 h,每个时间点每个试验孔设3个重复。将每个试验孔的细胞培养液离心取上清,应用制备的PMAP-23特异性单克隆抗体建立抑制ELISA,在翻译水平上研究不同浓度乳铁蛋白不同作用时间对猪抗菌肽PMAP-23基因分泌表达的影响。结果表明,将不同浓度乳铁蛋白处理的猪骨髓细胞分别培养3 h和6 h后,随着乳铁蛋白浓度的升高,骨髓细胞培养上清中抗菌肽PMAP-23的含量也不断升高,尤其在乳铁蛋白浓度为1000μg/mL时,猪抗菌肽PMAP-23的表达量显著升高(P＜0.05),表明一定浓度的乳铁蛋白能够在翻译水平显著促进抗菌肽PMAP-23基因的表达;而作用12h和24h时,添加不同浓度的乳铁蛋白对抗菌肽PMAP-23的表达则无显著影响,其具体机理有待于进一步探讨。