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研究背景：肠易激综合征(Irritable bowel syndrome, IBS)以腹痛或腹部不适为主要症状,排便后可改善,常伴有排便习惯改变,缺乏可解释症状的形态学和生化学异常,临床以腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant IBS, IBS-D)尤为多见。IBS-D发病机制复杂,至今尚未完全阐明。近些年来,随着细胞生物学和分子生物学的不断开展,越来越多的证据显示本病的发生发展与肠上皮细胞紧密连接结构损伤、肠黏膜通透性增加密切相关,而该过程可能由肠黏膜免疫系统活化后释放的促炎细胞因子直接作用于上皮细胞紧密连接,下调紧密连接相关蛋白表达引起。在促炎因子触发紧密连接结构损伤的连锁反应中,TNF-a可能起到了关键作用。一方面可通过MLCK-MLC信号通路重塑细胞骨架微丝,导致紧密连接前的肌动球蛋白环收缩和紧张性增加,引起Occludin、Claudin-1、ZO-1等紧密连接蛋白及周围细胞骨架蛋白重新分布,使得紧密连接结构移位,细胞旁通路开放,肠黏膜通透性增加；另一方面可诱导IL-1p、IL-6、IL-8等促炎因子产生,形成级联放大效应,加强对肠上皮细胞紧密连接结构的损伤。现代医学对于修复促炎因子所致的肠上皮细胞紧密连接损伤尚无行之有效的办法。肠安Ⅱ号方是导师在治疗肝脾不和之痛泻名方“痛泻要方”的基础上,结合20余年的临床经验优选出的中药复方,具有疏肝健脾、温中止泻之功。本课题组前期以IBS-D病证结合大鼠模型为依托,初步探讨了肠安Ⅱ号方对肠黏膜免疫屏障及肠上皮细胞紧密连接的影响。研究结果表明,肠安Ⅱ号方可显著降低IBS-D病证结合大鼠血清中TNF-α、IL-1p等促炎因子的含量,降低肠黏膜通透性,同时可修复肠上皮细胞紧密连接损伤,但并未对该方可能的调控机制加以深入阐释。研究目的：本研究以TNF-α诱导的肠上皮细胞紧密连接损伤模型为依托,观察肠安Ⅱ号方对肠上皮细胞紧密连接结构的调控作用,并以MLCK-MLC信号通路及细胞因子失衡为切入点,探究肠安Ⅱ号方可能的分子调控机制。研究方法：1.Caco-2细胞在Transwell板分化21天建立肠上皮细胞紧密连接,并以TER动态变化、ALP活力、FD-4通透率及Papp,透射电镜下细胞形态为观察指标,评价紧密连接的形成过程。利用TNF-α诱导肠上皮细胞紧密连接损伤,并观察不同浓度TNF-α (0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL)作用24 h、48 h、72 h后TER的动态变化,以筛选TNF-α的最佳造模浓度及造模时间。2.建立肠上皮细胞紧密连接损伤模型后,将细胞分为6组：正常组(10%空白血清)、模型组(TNF-α+10%空白血清)、肠安Ⅱ号方高剂量组(TNF-α+10%高剂量含药血清)、中剂量组(TNF-α+10%中剂量含药血清)、低剂量组(TNF-α+10%低剂量含药血清)及阳性药物黄连素组(TNF-α+10%空白血清+100μM黄连素)。以24 h内TER动态变化、FD-4通透率、透射电镜下微绒毛形态及紧密连接结构为检测指标,观察肠安Ⅱ号方对肠上皮细胞紧密连接的调控作用。3.以MLCK-MLC信号通路为切入点,研究肠安Ⅱ号方对肠上皮细胞紧密连接的分子调控机制：造模及分组方法同上,采用激光共聚焦显微镜观察ZO-1、Claudin-1、F-actin蛋白在细胞膜的分布及NF-kB p65在细胞浆与细胞核的转移；采用Real-Time PCR检测MLCK mRNA的表达；采用Western-bloting检测ZO-1、Claudin-1、Occludin及MLCK、MLC与p-MLC的表达。4.采用ELISA检测促炎因子IFN-γ、IL-6、IL-8与抗炎因子IL-4、IL-10的表达,研究肠安Ⅱ号方对TNF-α触发的细胞因子失衡的调控作用。研究结果：1. TNF-α诱导肠上皮细胞紧密连接损伤模型的建立与评价结果提示：Caco-2细胞随着分化时间的延长,TER值逐渐增加,分化至第21天TER达(1568.08±206.46)Ω,cm2,并维持在一个较恒定的值；细胞单层顶侧与基底侧ALP活力比值达(4.85±0.25)；FD-4的通透率为(2.31±1.12)%,Papp为(1.95±0.9)×10-7cm·s-1；透射电镜下显示在细胞顶侧面分化出微绒毛和完整的紧密连接结构。不同浓度TNF-α作用24 h、48 h、72 h后,TER结果提示：正常组TER值逐渐升高,于48 h末达峰,随后缓慢下降直至72 h；而TNF-α 1 ng/mL、10 ng/mL及100 ng/mL组TER均先降低后升高,于24 h末降至最低。24 h末TER结果提示：与正常对照组相较,TNF-α 1 ng/mL、10 ng/mL及100 ng/mL组细胞TER值均明显降低(p<0.05)；其中TNF-α 10ng/mL与100 ng/mL组TER值明显低于TNF-a 1 ng/mL组(p<0.05)；但该两组TER值比较并无显著差异(p>0.05)。2.分别从整体细胞水平及微观细胞形态研究肠安Ⅱ号方对肠上皮细胞紧密连接的调控作用(1)整体细胞水平：①TER结果提示：模型组TER持续下降,于24 h降至最低。各用药组TER值均先升高后降低,于6h达峰,此后逐渐下降,但仍高于模型组,其中以肠安Ⅱ号方高剂量组出现作用时间最早且持续时间最长。②FD-4通透率结果提示：与正常组相较,模型组FD-4通透率显著升高(p<0.05)；与模型组相较,各用药组FD-4通透率均明显降低(p<0.05),但用药各组之间无明显差异(p>0.05)。(2)微观细胞形态：透射电镜结果提示：正常组细胞表面微绒毛分布均匀,排列整齐；紧密连接结构完整、连接致密、桥粒密度较高。模型组细胞表面微绒毛减少,长短不一,分布不均且排列散乱；紧密连接结构不完整,部分断裂,连接疏松,桥粒密度下降且缝隙连接明显增宽。与模型组相较,各用药组细胞微绒毛的形态及紧密连接结构均得到一定修复。3.基于MLCK-MLC信号通路研究肠安Ⅱ号方对肠上皮细胞紧密连接的分子调控机制(1)肠安Ⅱ号方调控紧密连接蛋白在细胞膜表面的分布与表达激光共聚焦显微镜结果显示：正常组细胞Claudin-1、ZO-1及F-actin荧光主要沿细胞膜呈蜂巢状线性分布,排列紧密,边缘光滑：模型组细胞荧光强度减弱,荧光信号有中断现象,且Claudin-1绿色荧光信号出现了从细胞膜向细胞浆弥散。与模型组相较,各用药组中断的荧光信号均得到一定修复,其中以肠安Ⅱ号方高剂量组作用最为显著。Western-bloting结果显示：与正常组相较,模型组中,ZO-1的表达降低(p<0.05)；与模型组相较,仅有肠安Ⅱ号方高剂量组ZO-1表达上调(p<0.05)。TNF-α对Occludin、Claudin-1的表达无明显作用。(2)肠安Ⅱ号对肠上皮细胞骨架微丝的分子调控机制① NF-kB p65免疫荧光结果显示：正常组NF-kB p65绿色荧光存在于细胞浆中,而模型组则出现了NF-kB p65绿色荧光由细胞浆向细胞核的转移,出现细胞浆和细胞核共染。与模型组相较,各用药组的绿色荧光大部分在胞浆内,细胞核中并未出现明显的荧光染色。② MLCK mRNA结果显示：与正常组相较,模型组中MLCK mRNA表达量明显增高(p<0.05)；与模型组相较,各用药组MLCK mRNA的表达均明显降低(p<0.05),其中以黄连素组降低最为显著(p<0.05)。③ MLCK、MLC、p-MLC Western-bloting结果显示：与正常组相较,模型组中MLCK、MLC及p-MLC的表达明显升高(p<0.05)。与模型组相较,肠安Ⅱ号方高、中、低剂量组及黄连素组MLCK表达均明显降低(p<0.05),其中以高剂量组降低最为显著：肠安Ⅱ号方高剂量组与黄连素组MLC表达降低(p<0.05),仅有肠安Ⅱ号方高剂量组出现p-MLC表达下调(p<0.05)。4.肠安Ⅱ号方对TNF-α诱导的细胞因子失衡的调控作用ELISA结果显示：与正常组相比,模型组中IFN-γ、IL-6、IL-8的含量均明显升高(p<0.05)；与模型组相较,各用药组中IFN-γ、IL-6、IL-8含量均明显降低(p<0.05),其中在IFN-γ、IL-8上肠安Ⅱ号方呈现剂量依赖性,以高剂量组作用最佳。与正常组相比,模型组中IL-4、IL-10的含量明显降低(p<0.05)；与模型组相较,仅有肠安Ⅱ号低剂量组及黄连素组IL-4含量升高(p<0.05),IL-10的含量亦仅有黄连素组升高有统计学差异(p<0.05)。研究结论：1. Caco-2细胞Transwell板分化21天后可建立肠上皮细胞紧密连接,’TNF-α可诱导肠上皮细胞紧密连接损伤,并呈现时间与剂量依赖性,以30 ng/mL作用24 h为最佳造模剂量与造模时问。2.肠安Ⅱ号方可改善微绒毛形态、修复上皮细胞紧密连接损伤降低细胞旁通透性。3.肠安Ⅱ号方高剂量组可通过MLCK-MLC信号通路抑制NF-kB p65由细胞浆向细胞核转移,进而下调MLCK转录、翻译及MLC磷酸化,抑制细胞骨架微丝蛋白及紧密连接蛋白重塑,从而修复肠上皮细胞紧密连接结构。4.肠安Ⅱ号方可通过下调促炎因子IFN-γ、IL-6、IL-8表达以拮抗TNF-a触发的细胞因子失衡状态,尤以高剂量组作用显著。