论文部分内容阅读
三酰甘油(triacylglycerol,TAG)是动物、植物、微生物和微藻细胞主要的储藏性脂类,它可应用于食品、轻工业和生物燃料等方面,是一种新型可再生能源——生物柴油生产的重要原料。与高等油料作物相比,微藻具有光合作用效率高、生长速度快、油脂产量高、不占用农业耕地和适应多种生长环境等优势,是一种潜在的新型生物柴油生产原料。莱茵衣藻作为模式单细胞生物,是研究油脂代谢基因的理想藻株。目前的研究表明,真核生物TAG的合成主要通过Kennedy路径:依赖于酰基CoA的从头合成途径,通过相关酶催化G-3-P及其后面的酰基化反应最终合成TAG。甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)和磷脂二酰甘油酰基转移酶(phospholipid:diacylglycerol acyltransferase,PDAT)均是Kennedy途径上的关键酶。本研究分别克隆莱茵衣藻內源的两个甘油-3-磷酸酰基转移酶基因(GPAT1、GPAT2)和一个磷脂二酰甘油酰基转移酶基因(PDAT),并转入野生型莱茵衣藻CC849基因组中过表达,进而改变莱茵衣藻TAG的含量。本论文的具体研究结果如下:1.通过PCR扩增获得莱茵衣藻GPAT1、GPAT2和PDAT基因的全长,并用生物信息学分析基因结构发现,GPAT1基因的编码序列长1233 bp,编码410个氨基酸;GPAT2基因的编码序列长1371 bp,编码456个氨基酸;PDAT基因的编码序列长3123 bp,编码1040个氨基酸。2.构建PPH-GPAT1、PPH-GPAT2和PPH-PDAT过表达载体并通过珠磨法成功转入野生型莱茵衣藻CC849中,经BODIPY染色筛选获得GPAT1、GPAT2、PDAT基因过表达的工程藻株G1-2、G2-2、P-9。荧光定量PCR检测显示,与CC849相比,工程藻株G1-2中GPAT1基因的表达量上调了2.4倍;工程藻株G2-2中GPAT2基因的表达量上调了40%;工程藻株P-9中PDAT基因的表达量上调了60%。微藻TAG含量测定结果表明,工程藻株G1-2的TAG含量比CC849提高了40%;工程藻株G2-2的TAG含量比CC849提高了34%;工程藻株P-9的TAG含量比CC849提高了34%。这表明将GPAT1、GPAT2与PDAT基因在莱茵衣藻中过表达可以提高TAG含量。3.利用GC-MS分析转基因藻的总脂肪酸含量及组分,得到结果如下:G1-2的总脂肪酸含量为73.4μg/mg,与CC849相比提高了35%,其中提高最多的是亚麻酸(C18:3),较CC849增加了56%;G2-2的总脂肪酸含量为76.25μg/mg,与CC849相比提高了40%,其中提高最多的是亚麻酸(C18:3),较CC849增加了53%;P-9的总脂肪酸含量为77.1μg/mg,与CC849相比提高了41%,其中提高最多的是亚油酸(C18:2),较CC849增加了42%。本研究将Kennedy路径中关键酶的基因GPAT1、GPAT2和PDAT转入莱茵衣藻体内,采用持续型表达的启动子表达目的基因,实现目的基因的过表达,最终调控TAG的合成代谢,使藻细胞的油脂含量增加,以上研究为获得油脂含量高的转基因藻株用于生物柴油的生产提供一种新思路。