研究背景:气道炎症和气道高反应性是哮喘的基本特征。支气管哮喘产生气道高反应性机制的研究已经取得很大的进展,但其确切机制目前仍然没有明确,参与的可能机制包括:Th细胞作用失衡;嗜酸粒细胞等多种炎症细胞、炎症介质、黏附分子和细胞因子的作用;遗传因素;神经源性炎症;氧化应激状态等。国内外对气道反应性的各个可能机制进行了广泛的研究,例如,研究发现小鼠可在无气道嗜酸性粒细胞浸润的情况下出现气道高反应性;临床研究中鼻炎患者进行鼻变应原激发后,下气道在没有接触变应原的情况下出现气道炎症和反应性增高。1989年Gibson等首先报道的嗜酸粒细胞性支气管炎(EB)患者有气道嗜酸粒细胞增高,但患者肺通气功能正常,无气道高反应性,峰流速(PEF)变异率正常,无法诊断为支气管哮喘。EB是慢性咳嗽的主要原因,诱导痰和气道黏膜病理检查表明,EB与哮喘一样,存在以嗜酸性粒细胞为主的多种炎症细胞浸润,但EB为何缺乏气道高反应性?其原因仍然未明。本课题组一方面通过纤维支气管镜对EB和哮喘患者的气道黏膜进行免疫病理比较,并应用比较蛋白组学探讨EB和哮喘肺泡灌洗液中蛋白的差异表达,筛选出与气道高反应性、气流可逆性阻塞相关的蛋白,并初步发现EB的气道炎症较哮喘轻且主要分布在中心气道,EB患者常合并有变应性体质,如合并有变应性鼻炎、变应性皮炎、皮肤变应原测试阳性等。单纯变应性鼻炎无合并哮喘的患者进行鼻变应原激发后,下气道在没有直接接触变应原的情况下出现气道炎症和反应性增高,变应性鼻炎可加重哮喘患者的下气道症状,这些研究着重于上气道炎症对下气道的影响,但对于下气道变应原激发后是否能引起上气道炎症变化及高反应性的研究极少报导,哮喘患者是否上气道在没有直接接触变应原的情况下出现气道炎症和反应性增高?这对于研究气道高反应性的发生条件和机制有很好的启发作用,也具有很重要的临床意义。研究目的:应用不同大小的变应原颗粒雾化小鼠,尝试建立具有明显的EOS气道炎症、但无气道高反应性的BALB/c小鼠模型,并将该模型与哮喘模型进行病理学及蛋白组学的比较,以筛选鉴定与气道高反应性、气流可逆性阻塞相关的蛋白,为进一步研究气道炎症及气道高反应性的发生机制奠定基础;对小鼠气道不同部位进行变应原激发,探讨远端气道在无变应原直接刺激的情况下的气道炎症和反应性。研究内容:第一部分不同直径变应原对小鼠气道高反应性的影响及蛋白组学的比较分题1应用大颗粒变应原雾化建立无气道高反应性的嗜酸粒细胞性气道炎症小鼠模型及与哮喘模型气道炎症的比较方法:BALB/c雌性小鼠,分为3组,每组6~8只:大颗粒变应原雾化激发组(下称实验组,雾化颗粒的平均中位直径8.6μm)、小颗粒变应原雾化激发组(下称哮喘组,雾化颗粒的平均中位直径2.9μm)、生理盐水对照组(下称对照组)。致敏方法:第0、7、14天OVA(10μg)腹腔注射。实验组第28、29、30天用PARI TIA喷雾器雾化1%OVA 15min激发;哮喘组第28、29、30天用PARI LC STAR喷雾器雾化1%OVA 15min激发;对照组致敏、激发采用生理盐水。最后一次激发24、48、72、96h后应用美国BUXCO公司的有创气道阻力与肺顺应性检测系统(RC system)测定动物的气道反应性,并进行支气管肺泡灌洗观察气道炎症情况。在末次激发24和96h后,检测小鼠的气道炎症程度,按照气道周围EOS浸润的程度评0~4分,并观察肺实质的炎症情况。结果:1.气道反应性的测定:末次激发24、48、72、96h后,各组RL均有随Mch浓度升高而增加的趋势。哮喘组在各个浓度Mch的RL均高于实验组和对照组,表明哮喘组的气道反应性高于实验组和对照组,实验组与对照组的气道反应性差异在各个时间点均无统计学意义。2.实验组和哮喘组肺泡灌洗液中巨噬细胞百分率显著低于对照组(P<0.05),而中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞百分率显著高于对照组(P<0.01)。3.末次激发72、96h后,实验组肺泡灌洗液中EOS比例逐步下降,表明具有明显的嗜酸性粒细胞气道炎症、但无气道高反应性的BALB/c小鼠模型的气道炎症有逐步减轻的趋势,但并未观察到气道反应性的变化。4.末次激发24h后,哮喘组出现显著的支气管周围EOS等炎症细胞浸润,肺泡管及肺泡内可见EOS浸润,而实验组出现轻度的支气管周围EOS等炎症细胞浸润,肺泡管及肺泡内无EOS浸润炎症,末次激发24h后哮喘组气道炎症病理评分(3.15±0.21)显著高于实验组(1.75±0.07, P<0.05),末次激发后96h后哮喘组气道炎症病理评分(2.65±0.11)仍然显著高于实验组(1.15±0.05, P<0.05)。5.末次激发24~96h后,哮喘组肺泡管及肺泡内均可见EOS浸润,而实验组肺泡管及肺泡内均无EOS浸润炎症。结论:通过应用大颗粒变应原进行雾化激发,本实验初步成功建立了具有明显的嗜酸性粒细胞气道炎症、但无气道高反应性的BALB/c小鼠模型,其气道炎症程度轻于哮喘模型组,气道炎症主要在大气道周围,接近EB的临床病理特征。该模型为进一步研究气道高反应性的发生机制奠定了基础。分题2嗜酸粒细胞性支气管炎小鼠模型与哮喘小鼠模型蛋白组学差异表达的初步探讨方法:建立具有明显的嗜酸性粒细胞气道炎症、但无气道高反应性的BALB/c小鼠模型、哮喘模型及对照小鼠各4只,激发后24h处死取肺组织提取总蛋白质,利用固相pH梯度(immobilized pH gradient,IPG),双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)对总蛋白进行分离,然后行考马斯亮蓝染色,予ImageMaster 2D Elite 5.0分析软件进行凝胶图像分析,寻找无气道高反应性的小鼠模型、哮喘模型和正常对照组差异表达的蛋白质。应用基质辅助电离解析飞行时间质谱(matrix-assitsted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)对蛋白质进行序列分析,明确是何种蛋白质。结果:双向电泳图像对比分析表明,实验组与哮喘组和正常对照组肺组织蛋白表达有一定的差异。经质谱检测肽质量指纹谱与标准分子量、等电点对照分析鉴定出20个蛋白,分别为谷胱甘肽-S-转移酶M1(GSTM1)、热休克蛋白B1等,其中热休克蛋白B1在哮喘组表达上调、GSTM1表达下调。结论:电泳图像对比分析表明,实验组与哮喘组之间肺组织蛋白表达存在一定的差异。成功鉴定了该模型和哮喘模型之间的差异表达蛋白,其中GSTM1、热休克蛋白B1等可能参与气道高反应性的发生机制。第二部分气道不同部位激发对小鼠气道高反应性的影响分题1小鼠上气道阻力及反应性检测方法的建立方法:建立变应性鼻炎小鼠模型,滴鼻激发后麻醉,分离气管,胸廓开口处气管切开插管,近喉部气管切开插入18G插管进入鼻咽部,插管连接“T”形管,一端连接压力传感器,一端连接精密注射泵,应用灌注/吸引模型模拟呼气/吸气,流量1mL/s,检测鼻气道的压力差,计算出总阻力,并减去插管阻力得出鼻阻力,并对鼻腔进行组胺雾化激发,激发后3min检测阻力变化。两组的肺阻力也进行比较。气道功能检测后进行鼻灌洗收集鼻灌洗液(NLF)及鼻病理组织学分析。结果:鼻组织学显示鼻黏膜有明显的嗜酸性粒细胞浸润,对照组的基础鼻阻力为1.791±0.08 cm H2O ml?1 s?1,组胺激发后为3.037±0.48 cm H2O ml?1 s?1,鼻炎模型组的基础鼻阻力为3.659±0.39 cm H2O ml?1 s?1,组胺激发后为7.643±1.41 cm H2O ml?1 s?1,两组差异有统计学意义(P均<0.01)。对照组肺阻力为1.681±0.11 cm H2O ml?1 s?1。结论:我们成功建立了小鼠体内的鼻气道阻力及反应性检测方法,鼻阻力约占全气道阻力的50%以上,变应性鼻炎小鼠模型阻力和反应性明显增高,鼻黏膜肿胀是鼻阻力增高的因素。分题2单纯上气道变应性炎症对下气道反应性的影响方法:BALB/c小鼠腹腔OVA(100μg)致敏并在清醒状态下OVA(200μg)滴鼻激发,建立单纯的上气道变应性炎症模型,检测鼻气道的阻力和反应性,同时检测下气道阻力及反应性,与对照组进行比较。两组均进行鼻和肺病理组织学分析。结果:清醒状态下经鼻滴伊文思蓝溶液后发现绝大部分溶液分布在鼻腔,而在肺的分布与脾脏的分布无差异。单纯上气道炎症组出现明显的鼻阻力增加和反应性增高,鼻组织学和NLF显示鼻黏膜有明显的嗜酸性粒细胞浸润。同时出现下气道高反应性,肺组织有EOS浸润,BALF中炎症细胞比例增高。结论:单纯的上气道炎症可诱发下气道炎症和气道高反应性,说明下气道可在没有变应原直接接触的情况下出现气道高反应性。分题3单纯下气道变应性炎症对上气道反应性的影响方法:BALB/c小鼠腹腔OVA(100μg)致敏并经气管注射OVA(200μg)激发建立单纯的下气道变应性炎症模型,检测鼻气道的阻力及反应性,并检测肺阻力,与对照组进行比较。应用ELISA试剂盒检测NLF、BALF和血清中的IL-5,气道功能检测后进行鼻和肺病理组织学分析。结果:经气管注射伊文思蓝溶液后发现绝大部分溶液分布在小鼠下气道,而在鼻腔的分布与脾脏的分布无差异。小鼠出现下气道炎症伴有下气道高反应性,肺组织和BALF中有明显的EOS浸润,血清和BALF的IL-5中明显增高。鼻组织学和NLF显示鼻黏膜没有明显的嗜酸性粒细胞浸润,与对照组无差异。对照组的基础鼻阻力和组胺激发后的鼻阻力与单纯下气道炎症组比较差异无统计学意义。末次激发后12、24、72h鼻灌洗液中的IL-5水平与对照组均无明显差异(P>0.05)。结论:单纯下气道炎症不能诱发上气道炎症和高反应性。总结:1.采用不同大小变应原颗粒雾化吸入的方法率先建立了率先成功建立了无气道高反应性但有嗜酸性粒细胞气道炎症的小鼠模型,为探讨气道高反应性的发生机制奠定了基础。2.通过哮喘模型与该模型的比较,发现了谷胱甘肽-S-转移酶M1、热休克蛋白B1等多个可能参与气道高反应性的差异表达蛋白。3.在国内外首次建立了新的小鼠鼻阻力及反应性的检测方法,该方法操作简易、可靠,并建立了小鼠鼻灌洗方法学。4.小鼠单纯上气道炎症可诱发下气道炎症和高反应性,但单纯下气道炎症并不能诱发上气道炎症和高反应性。提示下气道的敏感性高于上气道,可以在没有直接变应原激发的情况下出现气道高反应性;上、下气道的双向联系可能具有方向性。