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油菜黑胫病(blackleg of oilseed rape)和油菜茎基溃疡病(stem canker of oilseed rape)分别由Leptosphaeria biglobosa(Lb)和L.maculans(Lm)引起,其中Lb含6个亚类,包括芸薹亚类(L.biglobosa‘brassicae’,简称Lbb)和加拿大亚类(L.biglobosa‘canadensis’,简称Lbc),危害油菜的Lm只有一个亚类,即Lm芸薹亚类(L.maculans‘brassicae’,简称Lm)。目前,我国油菜产区仅发现Lbb和Lbc存在,没有Lm存在。因而,Lm是我国的一个对外检疫对象。Lb的两个亚类(Lbb和Lbc)和Lm在油菜上造成的症状相近,其培养特征相似,难以鉴定。本研究基于环节导等温扩增技术(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)建立了一种高效快速、准确灵敏、简便易行的检测体系,对Lm、Lbb和Lbc实施高通量快速检测。取得的主要研究结果如下:(1)根据ITS-rDNA序列设计了检测Lb(包括Lbb和Lbc)以及Lm的特异性LAMP引物,并对环引物及其数目进行了筛选,最终确定保留了一条环引物检测Lb,保留两条环引物检测Lm。利用了RAPD技术(Random Amplified Polymorphic DNA)获得了特异性检测Lbb的LAMP引物,根据Lbc的ITS序列,利用人工碱基错配原理获得了特异性检测Lbc的LAMP引物。(2)以LAMP检测Lb体系为例,优化了反应体系中的试剂浓度(dNTPs、Mg~+、F3/B3、FIP/BIP、LF/LB),明确了最适的LAMP反应体系,并对反应时间和温度进行了优化,明确了最佳反应温度为65℃,最佳反应时间为40 min。对检测Lb、Lbb、Lbc和Lm这4个LAMP体系的特异性、灵敏性和实用性等进行了评估。结果表明:所设计的4组引物特异性好,能特异性检测出目标真菌,而对杂菌及近缘种真菌则不能扩增。检测灵敏性高,对目标真菌模板DNA的检测极限达到fg级,较常规PCR的灵敏度提高100~1000倍。而且具有实用性,可用于检测病组织中的目标真菌,也可用于快速鉴定Lbb、Lbc和Lm。(3)对提取目标真菌和病组织中的DNA方法进行了优化,利用TE缓冲液和NaOH溶液分别对目标真菌菌丝、分生孢子以及油菜病组织进行裂解,以释放其中的DNA,整个提取过程仅用时2 min,提取的DNA能满足LAMP检测要求。从DNA提取到完成LAMP反应仅需1 h。上述研究结果为快速准确及高通量检测Lbb、Lbc和Lm奠定了技术基础。