由于神经元凋亡而引起的神经元丢失是神经退行性疾病如帕金森病和老年性痴呆症的主要病理特征。阐明对神经元凋亡起关键性作用的蛋白质及其信号转导机制，对揭示神经退行性疾病发生的本质并寻找、确立药物靶点，从而进一步达到有效防治神经退行性疾病的目的，具有至关重要的意义。 转录因子ATF2在体内的分布非常广泛，在脑中的表达最高。ATF2属于碱性—亮氨酸拉链蛋白家族，它含有三个重要的结构域，即C—末端的碱性区(basic region)与亮氨酸拉链域(leucinzipper domain)，两者合称为b—zip域，以及N—末端的TAD域。ATF2通过b—zip与自身或c—Jun形成二聚体，然后与TRE反应元件结合。 ATF2的磷酸化修饰主要受JNK激酶调控，JNK可以使ATF2的69和71位的苏氨酸发生磷酸化，并增加ATF2的转录活性。TAD域的69和71位苏氨酸对于ATF2的转录活性是必需的。 目前研究发现，ATF2的靶基因有c—Jun、TNFα、FasL、cyclin A等，它们在细胞凋亡中具有重要作用。其中，ATF2与c—Jun的关系更为密切。首先，ATF2和c—Jun都是JNK的磷酸化底物；其次，ATF2主要与c—Jun结合形成二聚体与TRE位点结合，发挥转录功能；第三，c—Jun是ATF2的靶基因，c—Jun可以影响ATF2的核定位与降解过程。 ATF2与神经元凋亡的关系尚不清楚。 ATF2可能与神经元的存活有关。在多种神经损伤模型与临床尸检发现，ATF2总蛋白水平下降；敲除ATF2小鼠的存活率很低、小脑Purkinje细胞减少、前庭感觉器官萎缩、脑室扩大，表明ATF2在神经系统的发育中有重要作用。 有文献报道，ATF2可能与神经元凋亡有关。在冈田酸(okadaic acid，OA)诱导的海马神经元凋亡时，磷酸化的ATF2水平增加。体外培养的交感神经元撤除NGF凋亡模型中，ATF2的磷酸化水平增加，并早于ATF2的蛋白下降过程。未分化的PC12细胞中，组成性激活的ATF2突变体可以诱导细胞凋亡。 由于ATF2与c-Jun有密切关系，而c-Jun在神经元凋亡过程中是必需的，阻断JNK/c-Jun通路的任何一个环节，均可以保护神经元。因此，我们推测ATF2可能与神经元凋亡有关。 c-Jun作为一个经典的AP1家族成员，在神经元凋亡时不仅表达增加，而且是神经元凋亡所必需的。有文献报道，神经元凋亡时，7xAP1-Luc与c-jun(-1600/+170)-Luc的活性均增加。由于这两种位点结合的转录因子复合物完全不同：AP1主要结合c-Jun：c-Fos，TRE主要结合c-Jun：ATF2。转录因子c-Fos与神经元凋亡的关系目前尚不清楚，神经元凋亡时，c-Fos的表达水平有何改变，以及AP1与TRE究竟哪个位点的活性增加值得深入研究。 因此，本课题主要探讨以下几个问题： 1、神经元凋亡时，ATF2的磷酸化水平与转录活性是否增加； 2、神经元凋亡时，c-Fos的表达水平以及AP1与TRE位点活性的变化趋势； 3、ATF2的转录活性增加与神经元凋亡是否有关系？ 结果： 1、低钾(5mM KCl)诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型中，ATF2的磷酸化水平与转录活性增加 小脑颗粒神经元体外培养第7天，分别用25mM KCl(25K)或5mM KCl(5K)培养基处理0.5、1、2、4小时。收集蛋白后用Western Blot方法检测发现，低钾处理时，ATF2的69与71位苏氨酸磷酸化水平从0.5小时开始增加，2小时达到峰值，然后逐渐下降。Stripping PVDF膜后，分别与磷酸化特异的JNK、c—Jun抗体，ATF2、tubulin的抗体孵育，结果发现，磷酸化JNK与c—Jun水平也增加，与磷酸化ATF2的变化趋势基本一致。而ATF2蛋白水平没有明显变化。JNK抑制剂SP600125能取消ATF2的磷酸化。Gal4-ATF2报道基因结果发现，低钾处理时，Gal4-ATF2报道基因的活性增加3.5倍左右，T69/71A的突变体则没有活性。以上结果表明，低钾处理时，ATF2的磷酸化水平增加，并且是JNK介导的；ATF2的转录活性增强，并且是69/71位苏氨酸依赖的。 2、低钾诱导的神经元凋亡时，c—fos的mRNA水平与AP1位点结合能力下降，而TRE位点结合能力增加，并且有c—Jun与ATF2的参与 小脑颗粒神经元体外培养第7天，分别用25mM KCl或5mM KCl培养基处理1、2、4、6小时。分离总RNA，用半定量RT—PCR方法检测c—fos的mRNA水平。结果发现，低钾处理时，c—fos的mRNA水平从1小时开始即有明显降低，6小时更低。报道基因结果发现，7×AP1-Luc与pcoll—Luc在神经元中的活性很低，低钾处理没有增加；低钾处理时，c—jun(-1600/+170)—Luc的活性增加3倍左右，2个TRE位点去除的突变体则活性很低。以上结果表明，低钾诱导的神经元凋亡时，TRE的活性增强，AP1的活性则没有变化。 EMSA结果发现，低钾处理时AP1探针结合能力下降，TRE探针的能力增加。反应体系中加入特异性抗体发现，ATF2与c-Jun抗体均可使条带上移，表明ATF2与c—Jun可以与TRE位点结合。 3、负显性ATF2抑制c—jun启动子的活性并保护神经元 体外培养第6天的神经元，用钙磷沉淀法转染质粒。c—jun(-1600/+170)—Luc与pcDNA3.1或ATF2△N共转染24小时后，换成25K、5K模型8小时。收集细胞并测定报道基因的活性。结果显示，同25K处理相比，5K处理时，c—jun(-1600/+170)—Luc的活性增加2.5倍左右；共转染ATF2AN后，c—jun(-1600/+170)—Luc的活性降低至pcDNA3.1组的1/4左右。因此，负显性ATF2抑制了c—jun启动子的活性。 pEGFP与pcDNA3.1或ATF2△N共转染24小时后，换成25K、5K模型12小时。Hoechst33258(5μg/ml)染色以观察核形态，倒置荧光显微镜观察并拍照。以GFP阳性细胞数为总数，计算凋亡率。结果显示，5K处理时细胞的凋亡率约为63％；与ATF2△N共转染组，细胞的凋亡率下降至29％，明显小于5K处理组。以上结果表明，负显性ATF2对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡有保护作用。 4、小分子RNA干扰ATF2抑制c-jun启动子的活性并保护神经元 首先，我们克隆了大鼠源的ATF2质粒，测序结果与NM_031080完全同源。针对大鼠ATF2序列设计RNA干扰序列，并亚克隆到BS/U6载体。293细胞共转染大鼠源的ATF2质粒与ATF2干扰质粒，结果发现，ATF2干扰质粒几乎完全抑制了ATF2的表达。 c—jun(-1600/+170)—Luc与BS/U6或ATF2干扰质粒共转染，报道基因结果显示，ATF2干扰质粒能够抑制低钾诱导的c—jun(-1600/+170)—Luc的活性。pEGFP与BS/U6或ATF2干扰质粒共转染实验结果显示，ATF2干扰质粒处理组的凋亡率从60％下降到33％。以上结果表明，抑制内源性ATF2表达可以保护神经元。 5、组成性激活ATF2诱导神经元凋亡 体外培养第6天的小脑颗粒神经元，共转染pEGFP与pcDNA3.1或C2/ATF2质粒。24小时后，用倒置荧光显微镜观察拍照，统计GFP阳性的细胞数。结果显示，与空质粒组相比，C2/ATF2质粒处理组的GFP阳性的细胞数明显减少，神经元存活率下降为23％左右。以上结果表明，增强ATF2的转录活性可以诱导神经元凋亡。 共转染c—jun(-1600/+170)—Luc与C2/ATF2质粒，报道结果显示，C2/ATF2质粒使c—jun(-1600/+170)—Luc的活性增加8倍左右。以上结果表明，组成性激活的ATF2可以刺激c—jun启动子的活性增强。 把C2/ATF2与7×AP1-Luc质粒共转染，以C2/c—Jun质粒作为阳性对照。报道基因结果显示，C2/ATF2质粒处理组与空质粒组相比没有变化，而C2/c—Jun处理组则使7×AP1-Luc的活性增加100倍左右。以上结果表明，组成性激活的ATF2对7×AP1报道基因没有激活作用。 结论： 1、低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型中，ATF2的磷酸化水平与转录转录活性增强； 2、低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型中，c—fos的表达下降，AP1位点的活性降低，TRE位点的活性增加； 3、抑制ATF2的转录活性保护神经元免于凋亡，而增加ATF2的转录活性诱导神经元凋亡： 4、ATF2通过诱导c—Jun的表达介导神经元凋亡。