氮唑类抗真菌药物作用靶点是羊毛甾醇14-α去甲基化酶(sterol 14α-demethylase,又名CYP51)。准确探究氮唑类药物与CYP51酶的结合模式,有利于从靶酶角度设计合成活性更好的化合物。利用小分子荧光探针技术,与药物偶联,作为一种可视化工具,可对药物在细胞内的分布、与靶点结合或相互作用情况进行示踪。然而部分小分子荧光染料自身存在一些不足:1.脂溶性差,不易透过细胞膜,进入真菌细胞;2.染料发射光谱位于紫外及可见光区,而生物体及其组织在可见光的激发下自身会发射荧光,导致严重背景干扰,不适于细胞生物成像;3.染料始终带有荧光,需要洗去以降低背景,应用步骤繁琐,成像信噪比低。本文的研究目的是设计合成基于氮唑类抗真菌药物的小分子荧光探针用于真菌细胞CYP51酶成像并利用探针工具初步建立一种体外筛选化合物抗真菌活性的新方法。新型的硅基罗丹明染料,在保留传统罗丹明染料成像优点的同时,通过硅原子取代桥连氧原子,使自身发射波长红移至近红外光区(600~900 nm)从而适用于生物成像。我们在其基础上引入内酯螺环,合成出一种具有荧光“关-开”机制的新型探针。即未与靶点识别时探针自聚,内酯螺环封闭于自聚体内部,同时闭环,荧光淬灭;与靶点结合后自聚体解聚,同时通过内酯螺环开环产生荧光。我们选取氟康唑作为偶联药物,在其侧链引入长链连接子,通过缩合反应与两个不同结构的硅基罗丹明染料底物偶联,合成得到探针SiR-1,SiR-2。体外抗菌活性实验和计算机模拟结果显示两者均能进入CYP51活性口袋,与靶酶结合,发挥抑菌作用。光谱性质证实两个探针能产生自聚效应调控荧光的产生与淬灭。以体外实验作为基础,进一步,我们利用探针对真菌细胞成像。激光共聚焦实验表明,探针能顺利的进入真菌细胞中,并能够在“No-wash”的情况下对CYP51进行特异性成像。随后我们设计了一系列加药竞争性实验,发现不同浓度的氟康唑在真菌细胞内使探针荧光不同程度降低,而加入阴性对照药(作用于其他靶点的抗真菌药物)两性霉素B和89b均不能使荧光明显降低。接着我们利用探针对耐药白念珠菌和敏感白念珠菌进行成像,发现在耐药菌中加入氟康唑后探针荧光降低不明显,推测这可能由于耐药菌阻止或外排氟康唑所致。最后我们采用荧光酶标仪定性测定不同浓度氟康唑及伊曲康唑对真菌细胞中探针荧光降低的影响。以荧光降低率衡量药物活性,从药物与靶酶结合的角度,初步建立了一种体外筛选化合物抗真菌活性的新方法。综上,本课题设计合成出了两个新型氟康唑小分子荧光探针并将其应用到了鲜为研究的真菌细胞中,对CYP51进行特异性成像。本文首次较详细的探究了氮唑类药物与CYP51结合情况。我们利用探针的荧光性质,实现了体外对化合物抗菌活性的测定,为抗真菌药物活性的筛选提供了新思路,为真菌CYP51的深入研究做出了有力贡献。