犊牛腹泻严重危害我国奶牛养殖业,死亡率高、经济损失大、病因复杂、缺乏有效的防控技术。2018-2020年本研究团队调查了唐山市78家规模化奶牛场65715头犊牛,腹泻发病率平均约为11.96%,病死率约为40.37%,严重影响唐山市的奶牛产业发展。本研究旨在明确唐山市犊牛腹泻的主要传染性病原。采用实验室病原检测方法,对9种传染性腹泻病原进行流行病学调查,确定犊牛腹泻的主要病原,了解传染性腹泻病原存在现状及在奶牛养殖场的分布情况;建立主要病毒性病原的检测方法;研制治疗腹泻的复方中药制剂;为犊牛腹泻防治技术提供数据支撑。本研究对唐山市13个县（市、区）犊牛腹泻粪便进行9种病原检测,统计结果显示,在788份腹泻样品中,牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒阳性检出率分别为 29.82%（235/788）、29.44%（232/788）、18.02%（142/788）;大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌阳性检出率分别为43.53%（343/788）、22.46%（177/788）、11.55%（91/788）;隐孢子虫、球虫、贾第鞭毛虫阳性检出率分别为27.79%（219/788）、27.16%（214/788）、9.77%（77/788）。从混合感染情况来看,发现在788份样品中病毒、细菌、肠道原虫混合感染占样品总数的21.19%（167/788）,二重混合感染中以牛轮状病毒+牛冠状病毒、大肠杆菌+沙门氏菌、球虫+隐孢子虫为主,阳性检出率分别为 8.37%（66/788）、6.47%（51/788）、5.20%（41/788）,三重混合感染为牛病毒性腹泻病毒+隐孢子虫+大肠杆菌3.93%（31/788）,四重混合感染牛病毒性腹泻病毒+牛冠状病毒+大肠杆菌+沙门氏菌最高,为0.89%（7/788）,未检测到五重及以上混合感染。调查结果表明,在采样范围内的犊牛腹泻致病病原中,大肠杆菌所占比例最高,其次为牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒。唐山市犊牛腹泻病原主要集中在滦南县、滦州市和玉田县规模化养殖场,与养殖数量和养殖密度有关。在所有被检地区,滦南县牛病毒性腹泻病毒的感染率最高,阳性检出率为45.38%（59/130）,汉沽区牛轮状病毒和牛冠状病毒感染率最高,阳性检出率分别为55.00%（22/40）和37.50%（15/40）;古冶区大肠杆菌的感染率最高,阳性检出率为68.75%（11/16）,路南区沙门氏菌感染率最高,阳性检出率为35.89%（14/39）,迁安县产气荚膜梭菌的阳性检出率最高,为20.21%（19/94）;路北区隐孢子虫、球虫的感染率最高,阳性检出率分别为48.48%（16/33）,57.57%（19/33）,古冶区贾第鞭毛虫感染率最高,阳性检出率为18.75%（3/16）。不同地区奶牛场均存在三类病原的感染,且病原检出率有很大差异。一年四季均有传染性腹泻发病,春季、夏季牛轮状病毒感染率最高,阳性检出率为27.71%（46/166）、39.58%（114/288）;秋季是细菌、肠道原虫感染高发季节,大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌阳性检出率为 54.08%（106/196）、29.59%（58/196）、14.58%（28/196）,隐孢子虫、球虫、贾第鞭毛虫阳性检出率分别为 46.94%（92/196）、41.84%（82/196）、17.35%（34/196）;冬季则以牛病毒性腹泻病毒感染为主,阳性检出率为52.17%（72/138）。对获得的牛病毒性腹泻病毒E2基因进行了系统的生物信息学分析,截取具有高抗原性和亲水性的序列,合成并连接到原核表达载体pET-32a（+）,构建重组质粒pET32a-E2;将重组质粒转化至E.coli BL21（DE3）宿主菌,经 SDS-PAGE 和 Western blot鉴定,成功获得大小为39 kDa的牛病毒性腹泻病毒E2基因的最佳可溶性蛋白,且该蛋白特异性较好;建立的ELISA抗体检测方法中,酶标抗体1:10000倍稀释检测效果最佳;此方法组内及组间重复试验的变异系数均低于5%;特异性检测结果显示,与牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清均无抗原性交叉反应。建立了同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的多重荧光定量PCR方法。对牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的质粒标准品的最低检出限分别为1.19×102拷贝/μL、3.89×101拷贝/μL、3.74×101拷贝/μL,灵敏性比常规PCR高出100倍;与大肠杆菌、沙门氏菌、牛传染性鼻气管炎病毒无交叉反应,特异性较强;组内、组间变异系数均小于1%,具有良好的重复性;用建立的方法和常规多重PCR同时检测了 150份腹泻病料样品,同时检测出三种病毒混合感染的样本数两者的符合率为83.33%。结果表明,本试验建立的多重荧光定量PCR方法为临床诊断及流行病学监测提供了一种快速、敏感、特异的技术手段。以清热利湿、理气止痛、和中止泻为组方原则,研制复方中药制剂。研究该组方对小鼠半数致死量（LD50）、最大给药量的急性毒性。复方中药制剂的剂量增至21.50 g/kg时,小鼠未见死亡,无法测出该复方中药制剂的LD50;最大给药量试验期间,小鼠临床表现正常,未出现中毒现象,未发现死亡,且小鼠采食量和体重也未受到显著性影响（P＞0.05）,复方中药制剂的最大给药量为120 g/kg;血液学、血液生化指标均未表现出显著性差异（P＞0.05）;剖检未见心、肝和肾等脏器发生病变,各脏器系数两组间差异不显著（P＞0.05）。说明该复方中药制剂对小鼠机体无毒副作用。研究复方中药制剂对犊牛自然感染病毒性腹泻的治疗效果。采用单因素设计试验,将腹泻犊牛分为3组（复方中药治疗组、支持疗法对照组、复方中药+支持疗法治疗组）,另外选取无腹泻症状的健康犊牛为对照组,每组30头,试验期15 d,试验0d、3d、7 d、14 d称重、采血测定其血液指标。复方中药制剂能够有效改善病牛的临床腹泻症状,食欲增加,精神状态良好,相对增重80.89%,总有效率100%,效果优于临床单一使用支持疗法治疗。表明临床中合理使用复方中药制剂,能有效的治疗犊牛腹泻。本研究通过对唐山市犊牛腹泻病原的厘定,明确了唐山市犊牛腹泻的流行情况及相关的致病病原;建立了犊牛腹泻主要病毒性病原的检测方法;研制了治疗犊牛腹泻的复方中药制剂,并取得良好的应用效果。上述研究结果将为唐山市犊牛腹泻的预防和治疗提供数据参考。