结直肠癌是世界范围内严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。2015年最新统计结果显示,美国结直肠癌的发病率和死亡率在男性和女性中均高居第三位。在我国,随着生活方式和饮食结构的改变,结直肠癌的发病率也呈现逐年上升的趋势。近年来随着癌症研究的深入,结直肠癌诊断和治疗取得了很大进展,但结直肠癌的死亡率仍居高不下,给人类的健康带来严重危害。因此,深入开展结直肠癌发生、发展和转移机制的研究,寻找新的诊断和预后标志物具有非常重要的临床价值和社会意义。肿瘤干细胞理论是新近提出的一个理论。该理论认为,肿瘤内部存在着由少量细胞构成的亚群,具有自我更新和多向分化潜能,从而使肿瘤具有了异质性和高转移性等特性,这类细胞被称为肿瘤干细胞。很多学者就肿瘤干细胞理论进行了相关研究,但目前仍面临诸多挑战。目前用于实体肿瘤的标志物纷繁复杂,没有一个明确的特异性标志物可以将肿瘤干细胞分离鉴定。此外,这些标志物的证据多来自于细胞系和动物实验,缺乏人体肿瘤组织的证据。这些标志物在结直肠癌演进过程中的表达情况如何,是否可以作为结直肠癌预后标志物,目前还无明确定论。我们选取了的ALDH1A1、CD44v6、Lgr5和Nanog四个标志物进行研究。抑癌基因PTEN在肿瘤干细胞中亦发挥重要功能。有研究发现BMP4或胸腺素β4在抑制结直肠肿瘤干细胞致瘤性并诱导其分化的过程中PTEN表达上调。PTEN-Long是抑癌基因PTEN的同型蛋白,于2013年在Science最先被报道,此后陆续有几篇报道。PTEN基因编码55kd PTEN和75kd PTEN-Long两种蛋白。PTEN-Long是一段较长的蛋白质序列,由PTEN起始密码子ATG上游的CTG起始编码,在乳腺癌组织中可以检测到PTEN-Long的表达。在人乳腺癌及脑胶质母细胞瘤细胞中过表达PTEN-Long后可以抑制P13K信号通路的活性,进而抑制了细胞增殖,与PTEN的作用机制相似. PTEN-Long还具有信号肽前导序列,从细胞内分泌后,可进入到其他细胞发挥抑癌功能。此项里程碑式的研究引起了我们的兴趣,我们试图研究PTEN-Long在结直肠癌中所发挥的功能。本论文研究旨在探讨候选肿瘤干细胞标志物ALDH1A1、CD44v6、Lgr5和 Nanog在结直肠癌演进中表达的临床意义及PTEN同型蛋白PTEN-Long在结直肠癌中的功能。1.ALDH1A1、CD44v6、Lgr5和Nanog在结直肠癌演进中的表达及临床意义我们运用免疫组织化学的方法检测结直肠组织中的ALDH1A1、CD44v6、Lgr5和Nanog表达,研究对象为两组独立的样本。第一组为419例结直肠癌芯片(tissue microarray,TMA)样本,分析四指标与临床病理参数的关系及对预后的影响。第二组为常规病理切片样本,包括了217例腺瘤样本(105例低级别腺瘤和112例高级别腺瘤),72例肠原发灶和对应肝转移灶的样本,基于结直肠癌发生发展的分子模型,系统研究四指标在正常黏膜-腺瘤-肠癌原发灶-肝转移灶发展过程中的表达变化趋势。为了验证ALDH1A1研究结果的可靠性,我们在常规病理切片组增加了193例结直肠癌样本。1),ALDH1A1在结直肠癌演进中的表达及临床意义结直肠组织ALDH1A1不仅在细胞浆中阳性表达,细胞核中亦有阳性表达。结直肠癌的演进过程中,ALDH1A1在低级别腺瘤中表达最强,高级别腺瘤、肠原发灶和肝转移灶中表达下调,且后三者表达无差异[低级别腺瘤>(高级别腺瘤=肠原发灶=肝转移灶)]。另我们在肠癌和肝转移灶中亦观察到ALDH1A1间质阳性,且细胞核阳性样本常伴随间质阳性,两者存在正相关。Kaplan-Meier单因素生存分析提示ALDH1A1在细胞浆的表达与结直肠癌的预后无关,而ALDH1A1细胞核阳性与结直肠癌患者预后有关,且核阳患者预后较好。COX多因素生存分析提示ALDH1A1核阳为独立预后因素。2), CD44v6在结直肠癌演进中的表达及临床意义CD44v6在结直肠组织中的定位为细胞膜和细胞浆。结直肠癌演进过程中,CD44v6在腺瘤中表达最强,原发灶和肝转移灶表达较低。低级别腺瘤与高级别腺瘤表达无差异,原发灶和转移灶的表达无差异[正常黏膜<(低级别腺瘤=高级别腺瘤)>原发灶和肝转移灶]。我们还观察到CD44v6在肠癌前缘的表达水平均较中央区低。Kaplan-Meier单因素生存分析提示CD44v6表达与预后无明显统计学关系,但处于临界水平。CD44v6低表达患者预后相对高表达患者差,与有淋巴结转移患者CD44v6表达低结果一致。Spearman相关性分析提示CD44v6表达与E-cadherin表达呈明显正相关。3),Lgr5在结直肠癌演进中的表达及临床意义Lgr5在结直肠组织中的定位为细胞膜和细胞浆。结直肠癌演进过程中,Lgr5在高级别腺瘤中表达最强,低级别腺瘤次之,原发灶和肝转移灶表达再次之,正常黏膜最低,且原发灶和转移灶的表达无差异[正常黏膜<(低级别腺瘤<高级别腺瘤)>原发灶和肝转移灶]。Lgr5的表达与肠癌发生部位、组织学分级、浸润深度存在相关性,直肠、低级别肠癌和浸润深度较浅者Lgr5表达较高。Kaplan-Meier单因素生存分析提示Lgr5高表达患者预后较好,COX多因素生存分析提示Lgr5为独立预后因素。Lgr5的表达与核β-catenin的表达无关。4), Nanog在结直肠癌演进中的表达及临床意义本研究中Nanog在结直肠组织中的定位为细胞浆而非细胞核。结直肠癌的演进过程中,Nanog在高级别腺瘤中的表达强于低级别腺瘤,肠原发灶中的表达强于肝转移灶(正常黏膜<低级别腺瘤<高级别腺瘤>肠癌原发灶>肝转移灶)。Nanog的表达与肠癌发生部位、组织学分级和浸润深度存在相关性,直肠、低级别肠癌和浸润深度较浅的患者Nanog的表达较高。Kaplan-Meier单因素生存分析提示Nanog高表达患者预后较好,COX多因素生存分析提示Nanog为独立预后因素。5),四指标相关性分析结直肠癌中ALDH1A1的表达与Lgr5、Nanog的表达均无相关性。虽然CD44v6的表达与ALDH1A1、Lgr5、Nanog的表达均有相关性,但因其表达广泛,故临床应用价值不大.Lgr5和Nanog在腺瘤-肠原发灶-肝转移灶的发展进程中表达一致,具有正相关关系.Lgr5和N anog联合分析后发现Nanog+Lgr5+样本组与Nanog-Lgr5-组相比预后较好。6),基于预后指数的死亡风险预测模型建立及其预后价值我们采用随机化原则,随机选择80%TMA样本作为训练集,建立预后模型。20%样本作为验证集,对所建模型进行验证。在训练集样本中,淋巴结转移情况、远处转移情况、Lgr5表达和β-catenin入核情况具有独立预后意义。我们基于这4个因素计算预后指数(P rognostic Index, PI),与TNM分期相比,PI在判断结直肠癌患者1、3和5年生存情况时准确性更高。我们最终建立了以PI为变量的1、3和5年死亡风险预测模型,可以评估每个个体的生存情况,并且该模型在验证集中得到较好验证。2. PTEN-Long在结直肠癌中的功能研究我们运用商品化的PTEN抗体在结直肠癌组织及细胞系中检测到PTEN和少量PTEN-Long的表达,说明机体内存在交替翻译的现象。随后我们采用基因合成的方法获取以CTG作为起始密码子的PTEN-Long全长序列,构建入p3×FLAG-CMVTM-14表达载体中,得到PTEN-Long-CTG/ATG表达载体。为使PTEN-Long高效翻译,我们在CTG/ATG表达载体的基础上,将起始密码子CTG突变为ATG,构建了PTEN-Long-ATG/ATG表达载体。将两种载体分别转染入不表达PTEN的293FT细胞中,我们发现PTEN-Long ATG/ATG及PTEN-Long CTG/ATG在75kd处均有表达,但ATG/ATG较 CTG/ATG的表达量要高,提示这两种密码子被识别的效率不同,ATG为主导起始密码子,而CTG为次要起始密码子,与机体内的状态相吻合。有趣的是,在ATG/ATG组亦检测到少量外源55kdPTEN的表达,这与过表达载体默认第二个ATG仅作为蛋氨酸存在的原理相悖,提示当外源转染表达载体进入细胞时,同样存在不同起始密码子交替翻译的现象。我们还针对PTEN-Long的抗原表位,制备出了PTEN-Long特异性的兔多克隆抗体,因是多克隆抗体,效价较低,仅在PTEN-Long过量表达时验证了抗体的有效性。我们在DLD1, SW480, RKO三株肠癌细胞系中过表达PTEN-Long-ATG/ATG,筛选单克隆细胞株。同293FT细胞一致,在RKO细胞系中亦观察到交替翻译的现象。对筛选到过表达PTEN-Long的DLD1、SW480和RKO单克隆细胞株进行Transwell细胞迁移实验,发现PTEN-Long可以抑制肠癌细胞的迁移。综合以上对ALDH1A1、CD44v6、 Lgr5、Nanog和PTEN-Long在结直肠癌中的研究,我们得出以下结论：(1)ALDH1A1、CD44v6、Lgr5和Nanog可作为结直肠癌预后的分子标志物,各指标高表达预后较好,其中ALDH1A1核阳、Lgr5和Nanog为独立预后因素.Nanog和Lgr5联合分析可以提高预后价值,Nanog-Lgr5-结直肠癌患者预后最差。基于淋巴结转移情况、远处转移情况、Lgr5表达和β-catenin入核情况建立的以PI为变量的1、3和5年死亡风险预测模型在判断结直肠癌患者1、3和5年生存情况时具有较好的准确性,实现了个体化生存预测。(2) PTEN-Long为经典PT EN的同型蛋白质,两者在机体内存在交替翻译现象,且PTEN-Long在结直肠癌中发挥抑癌作用。