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圆锥角膜是一种相对常见的角膜致盲疾病，表现为中央角膜进行性变薄和突出，导致视力受损。胶原的异常降解是圆锥角膜的发病机制之一。胶原蛋白含量、结构发生改变导致角膜结构缺失，进而引发圆锥角膜。鉴于此，探讨角膜中胶原蛋白代谢的调节机制对揭示圆锥角膜的发病机理具有重要的意义。AQP1是最早发现的AQPs家族成员，参与白内障、青光眼等许多眼部疾病的发生。前期研究发现，AQP1在圆锥角膜成纤维细胞中的表达高于正常角膜成纤维细胞，推测AQP1可能参与了圆锥角膜的发生发展，但其作用机制尚不明确。本研究通过siRNA、过表达和药物处理调节正常角膜和圆锥角膜成纤维细胞中AQP1的表达，分析AQP1对角膜成纤维细胞胶原代谢的影响，探讨AQP1在圆锥角膜发生过程中的作用。研究结果可为进一步揭示圆锥角膜发生的分子机理奠定基础，并为临床诊疗提供潜在靶点。
本研究的主要工作及结论如下：
(1)采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测正常人角膜成纤维细胞及圆锥角膜成纤维细胞中AQPs基因的表达，结果发现：AQP1、AQP3、AQP4、AQP5和AQP11在圆锥角膜和正常角膜成纤维细胞中均有表达，其中AQP1的表达量最高，且在圆锥角膜成纤维细胞中的表达显著高于正常角膜成纤维细胞，表明AQP1基因可能在圆锥角膜发生过程中起重要作用。
(2)与正常角膜成纤维细胞相比，圆锥角膜成纤维细胞中胶原合成基因（COL1A2，COL3A1，COL5A3、COL6A1）、胶原修饰酶基因（P4HA、P4HB、PLOD2和PLOD3）、胶原交联酶基因（LOX1、2、4）的表达显著降低，而胶原降解酶基因（MMP1、MMP2、MMP3、MMP9）的表达显著升高，表明与正常角膜成纤维细胞相比，圆锥角膜成纤维细胞中胶原的合成和修饰降低，降解增加。
(3)构建AQP1基因的siRNA干扰片段和过表达载体，转染角膜成纤维细胞，通过qPCR和Western检测胶原代谢相关蛋白的表达变化，结果发现，siRNA沉默AQP1后圆锥角膜成纤维细胞中I、III型胶原蛋白的基因表达及蛋白含量均增加，总胶原蛋白含量增加。此外，其他胶原合成基因（COL5A3、COL6A1）、胶原修饰酶基因和TIMPs的表达上调，MMP3的表达下调。在正常角膜成纤维细胞中沉默AQP1后胶原含量及胶原代谢相关基因的表达变化与上述变化趋势一致，而过表达AQP1后相关基因的表达变化与干扰AQP1后的变化趋势相反。上述结果表明，AQP1与角膜成纤维细胞中胶原蛋白的代谢密切相关，抑制AQP1基因的表达可以增强角膜成纤维细胞中胶原蛋白的合成和修饰，降低胶原蛋白的降解。
(4)分别采用DCFH-DA探针法、分光光度法及qPCR检测干扰AQP1后角膜成纤维细胞内氧化应激水平的变化。结果发现，沉默AQP1后，圆锥角膜和正常角膜成纤维细胞内ROS水平和氧化损伤标志物MDA的含量显著降低，抗氧化酶的表达和总抗氧化能力显著升高，表明AQP1通过转运H2O2参与角膜成纤维细胞中氧化应激反应。
(5)siRNA干扰AQP1后，圆锥角膜成纤维细胞中TGFB（1-3）及其下游信号途径关键因子Smad2/3、STAT3的表达增加；正常角膜成纤维细胞过表达AQP1后TGF-β途径相关基因的表达降低。上述结果表明，AQP1可通过抑制TGF-β信号通路调节角膜成纤维细胞中胶原的合成和降解。
(6)采用乙酰唑胺（AZ）处理圆锥角膜成纤维细胞，检测胶原代谢及相关信号通路的表达变化，结果显示，AZ处理后圆锥角膜成纤维细胞中AQP1表达降低，胶原合成和修饰相关基因表达升高，降解基因表达降低，胶原蛋白含量升高；胞内氧化应激水平降低，TGF-β途径相关因子表达升高。结果表明，AQP1可通过转运H2O2提高细胞内氧化应激水平，并通过抑制TGF-β途径导致胶原合成和降解失衡，进而在圆锥角膜病变中发挥作用，乙酰唑胺药物可作为AQP1抑制剂调节圆锥角膜细胞中的胶原代谢。
本研究的主要工作及结论如下：
(1)采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测正常人角膜成纤维细胞及圆锥角膜成纤维细胞中AQPs基因的表达，结果发现：AQP1、AQP3、AQP4、AQP5和AQP11在圆锥角膜和正常角膜成纤维细胞中均有表达，其中AQP1的表达量最高，且在圆锥角膜成纤维细胞中的表达显著高于正常角膜成纤维细胞，表明AQP1基因可能在圆锥角膜发生过程中起重要作用。
(2)与正常角膜成纤维细胞相比，圆锥角膜成纤维细胞中胶原合成基因（COL1A2，COL3A1，COL5A3、COL6A1）、胶原修饰酶基因（P4HA、P4HB、PLOD2和PLOD3）、胶原交联酶基因（LOX1、2、4）的表达显著降低，而胶原降解酶基因（MMP1、MMP2、MMP3、MMP9）的表达显著升高，表明与正常角膜成纤维细胞相比，圆锥角膜成纤维细胞中胶原的合成和修饰降低，降解增加。
(3)构建AQP1基因的siRNA干扰片段和过表达载体，转染角膜成纤维细胞，通过qPCR和Western检测胶原代谢相关蛋白的表达变化，结果发现，siRNA沉默AQP1后圆锥角膜成纤维细胞中I、III型胶原蛋白的基因表达及蛋白含量均增加，总胶原蛋白含量增加。此外，其他胶原合成基因（COL5A3、COL6A1）、胶原修饰酶基因和TIMPs的表达上调，MMP3的表达下调。在正常角膜成纤维细胞中沉默AQP1后胶原含量及胶原代谢相关基因的表达变化与上述变化趋势一致，而过表达AQP1后相关基因的表达变化与干扰AQP1后的变化趋势相反。上述结果表明，AQP1与角膜成纤维细胞中胶原蛋白的代谢密切相关，抑制AQP1基因的表达可以增强角膜成纤维细胞中胶原蛋白的合成和修饰，降低胶原蛋白的降解。
(4)分别采用DCFH-DA探针法、分光光度法及qPCR检测干扰AQP1后角膜成纤维细胞内氧化应激水平的变化。结果发现，沉默AQP1后，圆锥角膜和正常角膜成纤维细胞内ROS水平和氧化损伤标志物MDA的含量显著降低，抗氧化酶的表达和总抗氧化能力显著升高，表明AQP1通过转运H2O2参与角膜成纤维细胞中氧化应激反应。
(5)siRNA干扰AQP1后，圆锥角膜成纤维细胞中TGFB（1-3）及其下游信号途径关键因子Smad2/3、STAT3的表达增加；正常角膜成纤维细胞过表达AQP1后TGF-β途径相关基因的表达降低。上述结果表明，AQP1可通过抑制TGF-β信号通路调节角膜成纤维细胞中胶原的合成和降解。
(6)采用乙酰唑胺（AZ）处理圆锥角膜成纤维细胞，检测胶原代谢及相关信号通路的表达变化，结果显示，AZ处理后圆锥角膜成纤维细胞中AQP1表达降低，胶原合成和修饰相关基因表达升高，降解基因表达降低，胶原蛋白含量升高；胞内氧化应激水平降低，TGF-β途径相关因子表达升高。结果表明，AQP1可通过转运H2O2提高细胞内氧化应激水平，并通过抑制TGF-β途径导致胶原合成和降解失衡，进而在圆锥角膜病变中发挥作用，乙酰唑胺药物可作为AQP1抑制剂调节圆锥角膜细胞中的胶原代谢。