目的:肿瘤是当前世界范围内严重威胁人类健康的重大疾病,转移是引起临床肿瘤患者死亡的主要原因。在肿瘤转移的过程中,上皮间质转化(EMT)起到了非常重要的作用,肿瘤细胞可通过EMT获得间质表型,表现为具有更强的迁移、侵袭、转移能力,从而更具恶性,更易于发生转移。因此建立EMT研究模型对于探索肿瘤转移机制、筛选特异性好的肿瘤转移相关标志物具有重要意义。筛选获得的肿瘤转移及EMT相关标志物可用于临床肿瘤转移的早期判断和有效治疗。目前,研究EMT的主要策略可以分为两类:一类是通过施加特定的影响因素诱导肿瘤细胞发生EMT,包括给予TGF-β、转染EMT转录因子等;另一类是从异质性肿瘤细胞中筛选获得具有间质表型的高转移性亚系细胞,其筛选依据是基于异质性肿瘤组织和细胞系中存在的具有不同上皮和间质表型的亚群细胞,通过对比核酸、蛋白表达等方面的差异,获得EMT相关分子,作为判断肿瘤转移的重要依据,因此通过筛选亚系有助于发现新的EMT及转移相关标志物。具有间质表型的高转移细胞亚系可通过体内筛选法获得:向免疫缺陷小鼠体内注射肿瘤细胞,具有更强基质降解能力的细胞可形成转移灶,通过对转移灶肿瘤细胞进行扩大培养来获得具有间质表型的高转移力细胞亚系,该方法能较好地重现体内复杂的肿瘤转移环境,但是受到宿主差异的影响较大,而且费用较高、耗时较长。因此,体外筛选法日渐成为另一种重要的筛选策略,其典型代表为基于肿瘤生物学功能进行筛选的Transwell小室筛选法:通过稀释的基质胶模拟体内基底膜微环境,在物质浓度梯度驱动下收集获得具有更高侵袭能力、更强基质水解能力的间质表型亚系细胞,该法操作相对简便,易于标准化,在筛选新的标志物方面具有良好的可比性,但需要较多的筛选轮次。因此,建立更加高效、简便的肿瘤间质型高转移亚系的筛选方法具有很大的必要性。微流控芯片是近年来兴起的可将生物、化学等反应集成到一块微米尺度芯片中自动完成的新型微全分析系统,具有制备简便、易于集成、模拟性强、流体操控性强等优势,已广泛用于细胞分选、培养、侵袭、趋化、血管生成等研究中。本研究利用单泵控制浓度梯度形成的微流控芯片系统,提供持续稳定的浓度梯度及侵袭驱动力;通过浓度逐渐增加的基质胶提高筛选压力和筛选效率,利用间质表型细胞的强基质降解能力和侵袭能力对其进行有效富集,建立高效获得具有间质表型的高转移亚系的芯片筛选系统,为进一步筛选肿瘤转移和EMT相关标志物提供新的思路和可行性。microRNA(miRNA)是一类存在于真核细胞内的非编码RNA,其成熟体由18~25个核苷酸组成,通过与靶基因的3’UTR相结合而在转录后水平来抑制靶基因的表达,参与调节细胞增殖、分化、迁移、侵袭、转移等多种生物学过程。目前已知多种miRNA与肿瘤EMT和转移密切相关,但miRNA的表达及作用机制非常复杂:同一个miRNA可同时调控多个靶基因,而同一个基因也受到多个miRNA的调节,因此对转移和EMT相关miRNA的筛选和作用机制研究具有重要意义。肺癌现已成为发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,本研究拟通过建立的微流控芯片亚系筛选系统,对异质性肺癌A549细胞进行间质表型高转移亚系的高效筛选和鉴定,利用母系和亚系在侵袭、转移能力等方面的差异,进行miRNA表达谱分析,以期获得新的转移及EMT相关miRNA,并为肺癌转移及其调控机制的研究提供新的方案。研究方法:1.微流控芯片的制备和亚系筛选芯片系统的建立。(1)芯片制备。通过SU-8负光胶制备阳膜、PDMS浇注和固化、等离子封接,制备微流控芯片。(2)亚系筛选芯片系统的搭建。微流控芯片由泵液通道、细胞培养通道、基质胶通道和开放式细胞收集通道组成,通过单个微量注射泵和培养皿,将微流控芯片与含有不同浓度胎牛血清的培养基相连,可形成连续性血清浓度梯度,构建微流控芯片亚系筛选系统。(3)浓度梯度形成评价。利用PBS和FITC/PBS溶液,形成微流控芯片内稳定、连续性荧光强度梯度。2.肺癌间质表型高转移亚系的筛选和鉴定。(1)亚系筛选、收集和培养。利用PDMS芯片中的细胞培养通道,实现注入的细胞在微流控芯片中的长期培养;通过稳定的血清浓度梯度持续驱动细胞进行定向侵袭;利用基质胶模拟基底膜,通过逐步增加基质胶的浓度,提强筛选压力,提高筛选效率;利用芯片中与外界相连通的开放式细胞收集通道,对侵出芯片的细胞进行消化和收集,完成细胞亚系的体外筛选和培养。(2)亚系形态学评价。通过相差显微镜比较母系和亚系细胞的形态学差异。(3)亚系体外增殖能力评价。通过MTT、软琼脂单克隆形成等实验,比较分析母系、亚系细胞在体外增殖能力、单克隆形成能力、非锚定依赖性生长能力方面的差异。(4)亚系体外迁移、侵袭能力评价。通过划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验比较分析母系、亚系细胞在体外迁移、侵袭能力方面的差异。(5)亚系体内增殖、转移能力评价。通过裸鼠皮下成瘤实验、裸鼠转移癌模型的建立,比较分析母系、亚系细胞在体内增殖、转移等方面的差异。(6)亚系分子表达水平评价。通过Western blot检测细胞中EMT相关蛋白的表达差异。3.亚系中EMT相关miRNA的筛选、鉴定和功能验证。(1)通过miRNA表达谱芯片,筛选母系与亚系差异性表达的miRNA,并进行数据分析。(2)通过实时荧光定量PCR验证miRNA的表达,筛选鉴定EMT相关miRNA。(3)通过MTT实验比较miRNA mimics和inhibitor转染后细胞体外增殖能力的差异。(4)通过Transwell迁移和侵袭实验验证miRNA mimics和inhibitor转染后细胞体外迁移、侵袭能力的差异。(5)利用Miranda、MiRBase和Targetscan数据库进行靶基因预测与数据分析。(6)通过Western blot验证miR-200b-3p对靶基因ZEB1及下游E-cadherin表达的调控。结果:1.微流控芯片的制备及亚系筛选系统的建立。(1)芯片制备。制备了含有泵液通道、细胞培养通道、基质胶通道和开放式细胞收集通道四个不完全连接的PDMS-玻璃微流控芯片。(2)梯度形成评价。利用PBS和FITC/PBS溶液形成了从泵液通道到开放式细胞收集通道的荧光强度渐增的稳定连续性梯度。(3)亚系筛选系统的建立。将注有基质胶和肺癌细胞的微流控芯片置入含有高浓度胎牛血清的培养基中,通过单一微量注射泵泵入含有低浓度胎牛血清的培养基,建立了微流控芯片亚系筛选系统。2.肺癌间质表型高转移亚系的筛选和鉴定。(1)间质表型亚系的筛选及形态学变化评价。利用芯片中开放式细胞收集通道,对侵出芯片的肺癌A549细胞进行收集和扩大培养,重复该筛选过程,并逐步提升基质胶浓度(稀释度从2:1至1:2)以提升筛选压力,仅经过三轮筛选即获得了肺癌亚系A1、A2、A3细胞,各亚系细胞具有间质细胞典型的梭形细胞形态。(2)体外增殖能力评价。软琼脂单克隆形成实验表明A3亚系细胞具有更强的单克隆形成能力及非锚定依赖性生长能力,符合间质表型细胞的增殖特征。(3)体外迁移和侵袭能力评价。划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验表明A3亚系较母系A549细胞具有更强的体外迁移和侵袭能力,符合间质表型细胞的特征。(4)体内增殖、转移能力评价。裸鼠体内转移实验表明A3亚系细胞具有较低的增殖速度和更强的转移能力,符合间质表型高转移细胞的特征。(5)分子表达差异评价。Western blot结果表明A3亚系细胞中E-cadherin、ZO-1的表达显著下调、ZEB1、fibronectin、vimentin和MMP-9的表达显著上调,与间质表型高转移细胞的分子表达相一致。3.EMT相关miRNA的筛选、鉴定和功能验证。(1)EMT相关miRNA的筛选。miRNA表达谱芯片结果表明共计436个miRNA的表达存在差异(Fold change≥2),其中A3细胞较A549细胞表达上调的有259个,表达下调的有177个。(2)EMT相关miRNA的鉴定。利用实时荧光定量PCR验证芯片检测结果,结果显示miR-200b-3p与miR-194-5p在A3亚系细胞中的表达显著下调。(3)miR-200b-3p的转染及功能验证。将miR-200b-3p的mimics、inhibitor分别转染A3和A549细胞,MTT实验表明转染后细胞的体外增殖能力无显著差异,Transwell迁移和侵袭实验结果表明转染miR-200b-3p mimics后,细胞的体外迁移、侵袭能力减弱,转染miR-200b-3p inhibitor后,细胞的迁移、侵袭能力增强。(4)miR-194-5p的转染及功能验证。将miR-194-5p的mimics、inhibitor分别转染A3和A549细胞,MTT实验表明转染后细胞的体外增殖能力无显著差异,Transwell迁移和侵袭实验结果表明转染miR-194-5p mimics后,细胞的体外迁移、侵袭能力降低,转染miR-194-5p inhibitor后,细胞的迁移、侵袭能力增强。(5)靶基因预测与分析。利用Miranda、MiRBase和Targetscan数据库进行miR-200b-3p和miR-194-5p等miRNA的靶基因预测和信号通路分析,预测到194条miR-200b-3p的靶基因和48条miR-194-5p的靶基因,且富集的信号通路包括Wnt、TGF-β、PI3K-Akt等EMT调节的关键性通路。(6)靶基因验证。选择miR-200b-3p的潜在靶基因ZEB1进行进一步验证Western blot检测显示:转染miR-200b-3p mimics和inhibitor后,ZEB1的表达分别发生了下调和上调,而E-cadherin的表达随之分别上调和下调,表明miR-200b-3p通过抑制ZEB1的表达,促进E-cadherin的表达,进一步调节细胞的迁移和侵袭。结论:1.基于单泵控制的微流控芯片,建立了肿瘤间质表型高转移亚系的芯片筛选系统,并对肺癌A549细胞系进行了高效筛选,获得间质表型高转移性亚系A3细胞。通过逐级增加微流控芯片中基质胶浓度的筛选策略可高效获得亚系,为间质表型高转移亚系的筛选提供了新方法。2.利用获得的亚系A3细胞,进一步筛选、获得了与肿瘤转移和EMT相关的miR-200b-3p和miR-194-5p,miR-200b-3p和miR-194-5p参与调节肺癌细胞的迁移和侵袭,miR-200b-3p可通过抑制靶基因ZEB1而上调E-cadherin的表达。亚系细胞中EMT调节的关键性信号通路Wnt、TGF-β、PI3K-AKT等得到了富集。表明本研究建立的微流控芯片亚系筛选系统不仅可以筛选获得肿瘤具有间质表型的高转移亚系,还可基于获得的亚系细胞,进一步筛选miRNA等肿瘤转移及EMT相关标志物,为筛选更多肿瘤转移和EMT标志分子提供新思路和新方案。