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研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,大量流行病学调查表明,长期慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是导致HCC的主要病因。近年来研究发现乙型肝炎病毒X基因(hepatitis B virus X gene, HBx)在HBV相关HCC的发生发展中发挥重要的作用。HBx能通过多种方式影响肝细胞的凋亡,研究发现HBx对肝细胞凋亡的调节是HBV引起HCC的重要机制之一,然而HBx对肝细胞凋亡过程的调节作用仍存在争议,其确切机制尚不清楚。有研究显示HBx能促进细胞凋亡,但是也有研究显示HBx抑制细胞凋亡。有趣的是,一些研究发现在HBV相关的HCC组织中HBx基因常常发生缺失,尤其是羧基端的缺失。HBx羧基端的缺失可能改变了野生型HBx在控制细胞增殖、分化、凋亡方面的作用,从而在HBV相关HCC中发挥重要作用。我们前期的研究也显示,与野生型HBx相比,缺失突变型HBx能明显促进肝细胞的恶性转化,但其具体的分子机制尚有待阐明。微小RNA(microRNA, miRNA)是一类在转录后水平调控基因表达的小分子RNA,参与发育、细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程,在多种人类疾病包括肿瘤的发生中发挥着重要的作用。在肿瘤中miRNA表达的上调或下调可能起到癌基因或抑癌基因的作用。最近研究表明miRNA可能与HCC的发生与发展密切相关,但是miRNA在HBV相关HCC中的作用机制尚不十分清楚。研究目的通过对野生型HBx (HBx)和缺失突变型HBx (HBx-d382)真核表达载体转染肝细胞的生物学行为、细胞凋亡和microRNA表达谱的研究,探讨HBx与HBx-d382对肝细胞凋亡及microRNA表达的影响,以及这些变化在肝细胞恶性转化中的作用。研究方法(1)复苏分别含pcDNA3.0、pcDNA3.0/HBx及pcDNA3.0/HBx-d382质粒的重组细菌DH-5α,提取质粒并用PCR、双酶切法鉴定质粒,对质粒进行DNA测序并应用DNASIS MAX2.9、clusterW生物软件进行分析。(2)应用脂质体转染的方法,将质粒pcDNA3.0、pcDNA3.0/HBx和pcDNA3.0/HBx-d382转染入L02肝细胞中,用G418筛选出稳定表达HBx和HBx-d382蛋白的肝细胞株。(3)用放线菌素D (Actinomycin D, ActD)、肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor a, TNF-a)处理L02、L02/pcDNA3.0、 L02/HBx和L02/HBx-d382组肝细胞,诱导肝细胞凋亡。用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭(Annexin V-fluorescein isothiocyanate/Propidium iodium, Annexin V-FITC/PI)双染色流式细胞分析法检测并比较ActD、TNF-a处理0小时,12小时,24小时,48小时各组肝细胞凋亡情况；用终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记(terminal deoxynucleotidy1transferase mediated dUTP nick end labelling, TUNEL)法检测并比较ActD、TNF-a处理24小时各组肝细胞凋亡情况；用RT-PCR (reverse transcription polymerase chainreaction)和Western-blot检测L02、L02/pcDNA3.0、L02/HBx和L02/HBx-d382组肝细胞中Survivin、PTEN (phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten, PTEN) mRNA和蛋白的表达。(4)利用microRNA芯片,以L02/pcDNA3.0细胞为对照,研究分析HBx-d382和HBx转染L02肝细胞后肝细胞内miRNA表达谱的变化。研究结果(1)证实了野生型HBx (HBx)和缺失突变型HBx (HBx-d382)真核表达载体构建正确,并成功建立了稳定表达HBx和HBx-d382蛋白的肝细胞株。(2) Annexin V-FITC/PI流式细胞分析显示,ActD、TNF-a处理前,L02、L02/pcDNA3.0、L02/HBx-d382和L02/HBx组细胞早期凋亡率分别为(3.38±0.53)%、(3.95±0.29)%、(3.23±0.69)%、(10.34±0.74)%：ActD、TNF-a处理12小时时L02、L02/pcDNA3.0、L02/HBx-d382和L02/HBx组细胞早期凋亡率分别为(4.07±0.27)%、(4.69±1.04)%、(4.09±0.16)%、(9.83±1.02)%;ActD、TNF-a处理24小时时L02、L02/pcDNA3.0、L02/HBx-d382和L02/HBx组细胞早期凋亡率分别为(19.30±3.00)%、(20.82±2.43)%、(18.18±2.48)%、(28.37±3.50)%;ActD、TNF-a处理48小时时L02、L02/pcDNA3.0.L02/HBx-d382和L02/HBx组细胞早期凋亡率分别为(35.25±5.17)%、(35.73±4.21)%、(31.13±4.50)%、(45.65±3.37)%。ActD、TNF-a处理前及处理后,L02/HBx组细胞早期凋亡率均高于L02、L02/pcDNA3.0和L02/HBx-d382组(p<0.05),而后3组细胞之间早期凋亡率差异无统计学意义(p>0.05)；与ActD、TNF-a处理前相比,ActD、TNF-a处理12小时时L02、L02/pcDNA3.0、 L02/HBx-d382和L02/HBx组细胞早期凋亡率与处理前比较差异无统计学意义(p>0.05); ActD、TNF-a处理24小时和48小时时L02、L02/pcDNA3.0、L02/HBx-d382和L02/HBx组细胞早期凋亡率均增加(p<0.05),且处理48小时时各组肝细胞早期凋亡率均高于处理24小时时(p<0.05)。TUNEL法检测显示ActD、TNF-a处理24小时时L02、L02/pcDNA3.0、L02/HBx-d382和L02/HBx组细胞凋亡指数分别为(21.97±4.91)%、(23.49±3.26)%、(22.55±4.86)%、(33.68±4.43)%。L02/HBx组细胞细胞凋亡指数高于L02、L02/pcDNA3.0和L02/HBx-d382组(p<0.05),而后3组之间比较差异无统计学意义(p>0.05)。Survivin mRNA和蛋白在L02、L02/pcDNA3.0、 L02/HBx-d382和L02/HBx细胞中的相对表达强度分别为0.66±0.09和0.69±0.12、0.66±0.07和0.76±0.09、0.63±0.13和0.77±0.14、0.26±0.09和0.13士0.12。PTEN mRNA和蛋白在L02、L02/pcDNA3.0、 L02/HBx-d382和L02/HBx细胞中的相对表达强度分别为0.21±0.09和0.19±0.13、0.24±0.12和0.21±0.07、0.22±0.11和0.23±0.06、0.52±0.09和0.71±0.04。与L02、L02/pcDNA3.0和L02/HBx-d382细胞相比,L02/HBx细胞中Survivin mRNA及蛋白表达下调(p<0.01), PTEN mRNA及蛋白表达上调(p<0.01); Survivin、PTEN mRNA和蛋白在L02、L02/pcDNA3.0细胞和L02/HBx-d382细胞中的表达差异无统计学意义(p>0.05)。(3) microRNA芯片结果显示,与L02/pcDNA3.0相比较,L02/HBx肝细胞内hsa-miR-7、hsa-miR-1274a、hsa-miR-137、hsa-miR-6634种miRNA表达上调,hsa-miR-338、 hsa-miR-24、hsa-miR-29、hsa-miR-744、hsa-miR-455、 hsa-miR-324、hsa-miR-551b、hsa-miR-340、hsa-miR-590hsa-miR-660、hsa-miR-11311种miRNA表达下调；而L02/HBx-d382肝细胞内hsa-miR-501、hsa-miR-595、hsa-miR-1307、 hsa-miR-1180、hsa-miR-497、hsa-miR-1246、hsamiR-6237种miRNA表达上调,hsa-miR-338、hsa-miR-551b、hsa-miR-1、hsa-miR-455、 hsa-miR-200c5种miRNA表达下调。除均能引起hsa-miR-338、 hsa-miR-455、hsa-miR-551b表达下调外,HBx与HBx-d382引起肝细胞内表达上调或下调的miRNA的种类不同。结论(1)证实了野生型HBx (HBx)和缺失突变型HBx (HBx-d382)真核表达载体构建正确,并成功建立了稳定表达HBx和HBx-d382蛋白的肝细胞模型,为深入研究HBx和HBx-d382基因及其蛋白在HBV相关HCC中的作用奠定了基础。(2)野生型HBx(HBx)和缺失突变型HBx (HBx-d382)对肝细胞凋亡的影响是不同的。野生型HBx (HBx)可能通过下调Survivin表达并上调PTEN的表达发挥促细胞凋亡的作用,而缺失突变型HBx(HBx-d382)可能具有取消野生型HBx促细胞凋亡的能力。HBx基因可能通过缺失型突变修饰其生物学功能,在HCC发生中起着重要的作用。(3)HBx和HBx-d382基因转染肝细胞后均能引起肝细胞内miRNA表达谱发生变化,但两者对肝细胞miRNA表达谱有不同的影响,HBx和HBx-d382可能通过影响不同miRNA的表达而影响肝细胞的凋亡。