论文部分内容阅读
目的：探讨枯否细胞(Kupffer cells, KCs)表达PD-L1在泡球蚴(E.m)感染抑制大鼠肝移植(OLT)急性排斥反应中的作用。方法：(1)建立BN大鼠感染E.m的动物模型。实验分三组：A组皮下注射接种感染组；B组开腹直视肝穿刺注射感染组；C组经皮肝脏穿刺接种感染组。3-4周龄BN大鼠每组20只,每只接种2000头节/ml的E.m悬液0.2ml。感染3个月后观察各组的感染率,死亡率,ELISA检测Th1类细胞因子干扰素γ(interferon-y, IFN-y)、和Th2类细胞因子白介素10(interleukin-10, IL-10)在血浆中的表达情况。(2)采用Kamada“二袖套法”建立大鼠OLT动物模型。实验分两组,对照组：Lewis (LEW)→Brown Norway (BN)(E.m-)n=30；实验组：LEW→BN(E.m+)n=30。术后各组随即分出6只大鼠观察其生存天数,于OLT术后1、3、5及7天分别处死6只大鼠取外周血及肝脏组织标本。光镜观察移植肝脏的病理学排斥分级；全自动生化分析仪检测外周血浆天冬氨酸转移酶(aspartate aminotransferase,AST)和总胆红素(total bilirubin,TBIL);ELISA检测Thl类细胞因子干扰素γ(interferon-γ, IFN-γ)、和Th2类细胞因子白介素10(interleukin-10,IL-10)在血浆中的表达情况,免疫组织化学检测PD-L1在两组移植肝脏中的表达情况,real-time PCR检测两组移植肝中PD-L1mRAN的表达。(3)分离培养实验组(E.m+)和对照组(E.m-)术后7天移植肝脏中KCS分别记为KCsE.m-和KCsE.m-,分离培养正常BN大鼠脾脏T淋巴细胞(TCs),单独或混合培养。实验分四组：KCs实验组：KCsE.m+;KCs对照组：KCsE.m-;混合培养实验组：KCSE.m++TCs;混合培养对照组：KCsE.m-+TCs;免疫组化检测KCs表面程序性死亡配体1(Programmed death ligand1, PD-L1)的表达情况。将KCs与TCs共同培养24h,MTT法检测TCs的增值,流式细胞计数法检测TCs凋亡情况,ELISA检测培养上清液中IFN-γ和IL-10的含量。结果：(1)观察皮下注射成功建立了Em感染大鼠模型,其中死亡0只,死亡率0%(0/20),感染率60%(12/20只),ELISA检测三种方法感染大鼠外周血中IFN-γ、IL-10的浓度无差异(P<0.05)。(2)采用改良的Kamad"二袖套法”成功建立了稳定的大鼠原位肝移植动物模型。发现实验组最长存活26天,平均生存天数10.2±2.13天。而对照组组于12天内全部死亡,平均生存天数22.5±4.04天,两组差异明显(P<0.05)。对照组大鼠术后血浆AST和TBIL呈现进行性升高,而实验组则上升缓慢,两组差异明显(P<0.05)。ELISA结果显示：对照组术后7天,血浆中INF-γ(分别为210.68±16.82、170.97±14.64和126.4±15.57,pg/ml)的浓度明显低于对照组(分别为753.50±12.68、509.83±17.91和427.97±13.49,pg/ml)组,而IL-10(371.13±17.63,pg/ml)的浓度则明显高于对照组(187.48±12.89,pg/ml)(P<0.05)。免疫组织化学结果显示：实验组术后第7天PD-L1呈强阳性表达并且表达范围广；而在对照组PD-L1表达始终较弱,两组比较有明显差异(P<0.05)。Real-time PCR检测PD-L1mRNA在实验组术后第7天呈强阳性表达并且表达范围广；而在对照组表达始终较弱,两组比较有明显差异(P<0.05)。(3)KCsE.m+组中PD-L1的表达明显高于KCsE.m-(P<0.05)。KCSE.m++TCs组中TCs的增殖(13258.34±951.26cpm)明显低于KCSE.m-+TCs组(3047.98±101.42cpm,P<0.05),而其凋亡率(8.83±0.37%)却显著高于后者(1.34±0.16%,P<0.05)。KCsEm++TCs组上清液中INF-γ的含量明显低于KCsE.m-+TCs组(P<0.05),但IL-10在KCs.m-+TCs组(108.8±12.89pg/ml)明显高于KCsE.m-+TCs组(49.13±17.63pg/ml,P<0.05)。结论：泡球蚴感染后可能通过上调KCs表面PD-L1的表达抑制TCs的增值促进TCs的凋亡进而减缓了肝移植急性排斥反应的发生