目的和意义自然环境是人类生存的重要基础。随着人类发展带来的污染和破坏,我们赖以生存的坏境条件变得越来越差,而恶劣的环境带来的也是更多的灾害与疾病。研究表明,糖尿病的发生不仅与胰岛功能有关,还受到遗传、环境、个人行为等多种因素的影响。现今临床上治疗糖尿病除了补充胰岛素之外,更多的是通过饮食和降血糖药物共同作用来控制体内血糖。α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,EC3.2.1.20)作为其中一种参与体内血糖代谢的关键酶类已受到广大学者的关注,通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性来降低对碳水化合物的吸收从而调节血糖成为临床上治疗2型糖尿病广泛使用的手段。开展对α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究,不仅能推动治疗2型糖尿病有关技术的发展,还能为有关环境污染的研究提供新的思路。a-葡萄糖苷酶,又称α-葡萄糖苷水解酶,为淀粉水解酶类中的一种,它能够作用于多糖的非还原末端,主要水解蔗糖和多聚糖的α-葡萄糖苷键,产生α-D-葡萄糖,同时它还能转移游离出来的葡萄糖残基到另一类底物中形成α-1,6糖苷键而获得非发酵性的复合糖脂或糖肽。人体中的a-葡萄糖苷酶主要位于小肠刷状缘膜上皮细胞,作为一种关键酶参与食物中碳水化合物的水解,对人体血糖的代谢控制有重要作用。由于它在2型糖尿病患者葡萄糖的吸收过程中具有潜在的下调作用,因而具有重要的临床意义。在酿酒行业的糖化反应过程中加入a-葡萄糖苷酶,可形成小分子低聚异麦芽糖,不但能降低发酵产生的乙醇含量,还能改善啤酒的口感。自从1982年日本林原生化研究所成功筛选出a-葡萄糖苷酶的生产菌种以来,相关的α-葡萄糖苷酶产品被大量应用于淀粉水解、酒精发酵、化学合成、疾病治疗、临床检测和有关代谢机理的研究。镉是仅次于汞、铅之后污染环境、威胁人类健康的第三种金属元素。由于其化学性质接近于锌,使得镉能破坏与呼吸及其它生理过程有关的碳酸酐酶、各种脱氢酶和磷酸酶,并能够同参与蛋白质和核酸代谢的蛋白酶、肽酶和有关酶反应,在葡萄糖磷酸化及碳水化合物生成和消耗所必需的酶系统中可能取代锌。镉离子的电荷和半径与钙离子非常接近,使其也有可能参与相关钙离子结合的生化过程,从而引发细胞内钙稳态失调。“饮水与健康”已经引起人们广泛关注,近年来有调查表明,饮用水的污染与某些疾病的发病率及死亡率有一定的关系。最为突出的是因饮水污染引发的肠道疾病。众所周知,人体内和体表存在着成千上万的微生物,经过长期的相互适应过程,这些微生物按特定的数量和种类定植于人体不同的部位。大量的研究证实,定植于人体的微生物群直接参与了宿主的各种代谢过程,发挥着重要而又独特的作用。此外受到环境因素的影响使得某些机会致病菌进入人体也会引发相关疾病。本研究通过阐明重金属Cd2+对α-葡萄糖苷酶的作用机制,有可能为糖尿病的防治提供重要的理论基础和新的思路。通过对比相关处理工艺对直饮水中微生物生态的影响,为我们探索饮用水菌群与健康疾病关联和相关病因学研究、预防和治疗的相关健康个性化医疗提供研究基础。方法1 Cd2+对α-葡萄糖苷酶活性和结构影响的研究1)测量不同浓度的Cd2+对α-葡萄糖苷酶的活性影响并记录数值。2)通过改变Cd2+和α-葡萄糖苷酶的浓度,固定底物浓度不变的方法分别测定不同条件下α-葡萄糖苷酶的活性,通过作图对比判断Cd2+对α-葡萄糖苷酶抑制作用的类型。3) 固定a-葡萄糖苷酶的浓度不变,改变Cd2+和底物浓度,测定Cd2+作用下α-葡萄糖苷酶的酶活性,利用获得的数据作双倒数图来判断抑制动力学参数。4)保持底物浓度和α-葡萄糖苷酶的浓度不变,按要求选取不同时间点测定不同浓度下Cd2+对α-葡萄糖苷酶活性的影响,根据所得结果绘制Cd2+对α-葡萄糖苷酶活性抑制变化时间过程图。5)利用内源荧光实验和ANS结合荧光光谱学分析方法分析a-葡萄糖苷酶三级结构特征。6)通过计算机模拟同源建模的方法,预测α-葡萄糖苷酶的3D结构以及Cd2+与a-葡萄糖苷酶的结合位点。2 Cd2+对直饮水中微生物生态的影响1)根据实验要求采集广州地区住宅小区分质供水样品并根据直饮水卫生标准中的相关方法测定直饮水的理化性质。2)通过微孔滤膜过滤富集剩下的直饮水样品,剪下滤膜利用试剂盒提取样品中的细菌总DNA。3)利用16SrDNA V4引物PCR扩增2)中提取的样品总DNA,并通过琼脂糖电泳验证扩增效率。4)将所得产物按实验需求混样并送至相关试剂公司进行Illumina Hiseq2000测序。5)根据测序结果利用相关统计学知识分析处理得出实验结果。结果1 Cd2+对a-葡萄糖苷酶结构和功能影响研究Cd2+对α-葡萄糖苷酶活性的影响存在着一个明显的剂量依赖效应。在Cd2+浓度为1.Ommol/L浓度时α-葡萄糖苷酶完全失活,半数抑制浓度为0.3863±0.033mmol/L.当忽略Cd2+对反应体系产生的稀释作用时,其半数抑制浓度为0.43mmol/L, Cd2+浓度达到1.2mmol/L时α-葡萄糖苷酶的活性完全丧失。另外我们还发现,低浓度(0.05mmol/L)的Cd2+对α-葡萄糖苷酶有一个激活作用(大约提高了1O%的活性)。通过测定不同浓度Cd2+存在的情况下α-葡萄糖苷酶的活性V和α-葡萄糖苷酶浓度E的关系图来明确Cd2+与α-葡萄糖苷酶作用的可逆性。结果显示所有的直线均通过坐标轴原点,表明Cd2+与α-葡萄糖昔酶的作用是可逆的。通过双倒数Lineweaver-Burk模型分析发现随着Cd2+浓度变化Vmax发生明显改变但Km固定不变,表明Cd2+对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型为非竞争性抑制。结果计算的Ki值为0.56±0.03mmol/L(n=3).通过动态时间监测来测量Cd2+对α-葡萄糖苷酶抑制的动力学时间效应。随着Cd2+浓度从低到高(0.05-0.8mmol/L),α-葡萄糖苷酶的活性没有明显的变化。Cd2+对酶的抑制作用在很短的时间内就能产生,意味着Cd2+与α-葡萄糖苷酶结合非常迅速,对a-葡萄糖苷酶活性的抑制没有明显的渐进动态过程。通过测量αα-葡萄糖苷酶的内源荧光判断Cd2+是否会引发α-葡萄糖苷酶的三级结构发生改变。实验发现随着Cd2+浓度的升高,α-葡萄糖苷酶内源荧光密度逐步降低,并且存在一个剂量依赖型的红移现象。实验结果明确的显示Cd2+能够引发α-葡萄糖苷酶三级结构发生改变,但需增加Cd2+的浓度到使α-葡萄糖苷酶完全失活的浓度的水平下才能发生。通过测量ANS荧光变化来监控Cd2+与α-葡萄糖苷酶结合后疏水表面的变化。我们发现随着Cd2+浓度的上升α-葡萄糖苷酶的ANS荧光密度也随之增加,二者呈剂量依赖型。为了获得α-葡萄糖苷酶同源模型,我们通过ACG鉴定模板结构,并用T-coffee与十个最好的模板序列比对。我们采用了10 ns的分子动力学模拟来评估Cd2+结合a-葡萄糖苷酶的作用。通过RMSD(均方根偏差)计分来比较两者结构的相似性。通过测量RMSFs来观察当Cd2+存在时两者结构如何发生改变。RMSFs显示两者模拟的结果相似,但Cd2+对其的效应更强。最终结构显示α-葡萄糖苷酶残基与Cd2+作用位点同ACG与镉离子作用位点相近。最终的结构显示Cd2+定位于α-葡萄糖苷酶的活性位点中心。这个现象表明了Cd2+能阻止糖苷酶活性位点进入糖类分子中水解糖类。2 Cd2+对直饮水中微生物生态的影响通过分析整理直饮水样品的理化性质数据我们发现,所有样品Cd2+含量均低于直饮水卫生标准中的限值,而在末梢水样本中我们发现有少许样品存在铅超标的情况,提示我们该地区的输水管道可能存在污染。对测序回来后的样品数据进行分析,我们发现直饮水样品的菌群丰富度较高,所有样品中菌群结构主要由Ralstonia、Bacteroidetes、Aquabacterium、Mycobacterium、 Bradyrhizobium、Sphingomonas为主要优势菌。通过分析对比不同处理工艺对直饮水中微生物多样性没有影响,菌群相似度较高。通过统计发现以Ralstonia为优势菌群的样品约占23.53%,以Sphingomonas为优势菌群的则多达61.76%,而以Bacteroidetes、Bradyrhizobium、Aquabacterium为优势菌群的均低于1%。目前已经发现Ralstonia菌属具有耐重金属作用,而低浓度下的Cd2+又能诱导增加α-葡萄糖苷酶的活性,暗示我们饮水中的微生物菌群作用可能会成为增加患糖尿病风险的因素之一。在通过饮水加标的方式验证不同浓度的Cd2+对饮水中微生物生态的影响实验中我们发现,随着Cd2+浓度的升高,水中微生物多样性下降,大部分细菌无法生长,γ-变形菌、拟杆菌、后壁菌数量上升,表明这些细菌对Cd2+有较好的耐受性,在该环境下能够生存繁殖。结论1)Cd2+可以导致a-葡萄糖苷酶的变性,但在低浓度的作用下对α-葡萄糖苷酶的活性具有诱导作用。2)Cd2+诱导的a-葡萄糖苷酶结构变化中,活性位点的稳定性较其他部分更高。3)Cd2+不直接与底物竞争,但会通过改变a-葡萄糖苷酶的三级结构影响酶的活性。4)Cd2+与α-葡萄糖苷酶配体结合导致了酶活性的混合型抑制。5)受Cd2+的影响,α-葡萄糖苷酶的结合位点的改变随着其整体结构的改变同时发生。6)所采集到的水样品中大部分地区水质指标合格,但部分地区末梢水指标中有铅离子超标的情况,提示该地区的输水管道材料可能存在泄露。7)不同处理工艺对直饮水中微生物多样性没有影响,菌群相似度高。8)三个行政区直饮水菌群结构可分为以下几类：1.以Ralstonia为主要优势菌、2.以Sphingomonas为主要优势菌、3. Ralstonia与Bacteroidetes同为优势菌、4. Aquabacterium、Mycobacterium和Bradyrhizobium等菌种的一种或两种为主要优势菌。9)高浓度的Cd2+能够抑制大部分细菌生长,部分细菌如Y-变形菌、拟杆菌、后壁菌数量上升,表明这些细菌对Cd2+有较好的耐受性。