结直肠癌为全球第三高发恶性肿瘤,其死亡率在所有恶性肿瘤中位居第四。已有研究显示,在结直肠癌中,合并2型糖尿病的患者其预后生存显著劣于非糖尿病患者。近年来人们发现,用于治疗2型糖尿病的经典口服药物二甲双胍具有降低恶性肿瘤发病率以及改善恶性肿瘤患者生存预后的功效。虽然目前已有诸多有关二甲双胍的抗肿瘤研究,但该领域尚有许多空白。上皮间叶转化(EMT)是上皮细胞失去极性、粘附性等上皮组织特征并获得迁移能力从而转化为间叶细胞的过程,该转化现象广泛发生于胚胎发育、组织修复、纤维化和肿瘤的发生发展等一系列生理病理过程中。有关研究已证实恶性肿瘤的侵袭、复发、转移和耐药等不良预后特征,均与肿瘤细胞的EMT有关。人们在二甲双胍的抗肿瘤研究中也发现了该药对前列腺癌、甲状腺癌、肺癌和乳腺癌细胞EMT的抑制作用,但其内在具体机制尚不十分明了,且该抑制作用是否同样存在于结直肠癌亦未得到明确。基于以往研究我们可以获知,细胞的上皮间叶转化(EMT)可以通过激活Wnt,Notch,TGF,JAK-STAT等多条信号通路来诱导,而来自于不同通路的EMT激活信号均会引发相似的效应,即细胞的上皮标志物E-cadherin的表达下降以及间叶标志物Vimentin及N-cadherin等的表达上升。上述EMT标志分子的表达改变最终将使细胞失去上皮样特性,转化为间叶细胞。多项研究证实由miRNA及转录因子构成的负反馈环调控结构Snail/miR-34及Zeb/miR-200在E-cadherin、Vimentin及N-cadherin等EMT关键分子的表达调控中起关键作用。在分处于上下游的两个负反馈环Snail/miR-34和Zeb/miR-200中,miRNA成分(miR-34和miR-200)对EMT起抑制作用,而转录因子成分(Snail和Zeb)对EMT起促进作用。miRNA和转录因子通过相互抑制来发挥对EMT信号的调节作用,而来自于上游各通路的上皮间叶转化(EMT)的激活信号受到来自Snail/miR-34和Zeb/miR-200两个负反馈环的依次调节,最终反映为EMT标志分子E-cadherin、Vimentin及N-cadherin的表达变化及细胞的上皮与间叶表型转化。此外,在该调控过程中,除了负反馈环结构外,其他因子诸如Twistl、GRHL2和OVOL也参与了对EMT信号的调节。本研究分析了二甲双胍对结直肠癌合并2型糖尿病患者的肿瘤上皮间叶转化表型和生存预后的影响,并藉由实验室研究探讨二甲双胍对结直肠癌的上皮间叶转化(EMT)调节中的关键负反馈调控环Snail/miR-34及Zeb/miR-200的调节效应,以及相关调控因子β-catenin、Twist、GRHL2及OVOL2在二甲双胍抑制EMT过程中的潜在作用,从而进一步明确了该药对结直肠癌EMT的调控方式,为阐明二甲双胍抗肿瘤效应的药理机制提供了参考。第一部分二甲双胍、上皮间叶表型与结直肠癌合并2型糖尿病患者的预后生存研究目的本课题采用回顾性分析探究结直肠癌合并2型糖尿病患者是否口服二甲双胍治疗与其肿瘤上皮间叶表型之间的关系,评估二甲双胍治疗以及肿瘤组织中上皮间叶标志物E-cadherin与Vimentin的表达与结直肠癌患者生存预后的关系。研究方法1)收集Ⅰ-Ⅲ期结直肠癌合并2型糖尿病患者的病例随访资料及原发瘤组织手术标本共102例;2)采用免疫组织化学染色对瘤组织标本中的E-cadherin和Vimentin的表达进行检测;3)使用统计软件SPSS 19.0对各项数据进行统计分析:t检验与Pearson’s χ2检验分别用于数值变量与分类变量的分析;采用Kaplan-Meier法及log-rank统计与Cox多变量回归进行生存分析。研究结果在102例患者中,服用二甲双胍者有28人,E-cadherin和Vimentin在所有患者中的阳性表达率分别为48.04%(49/102)和53.92%(55/102)。1)在相关性检验中,我们发现服用二甲双胍的患者其肿瘤细胞上皮间叶转化程度显著低于(E-cadherin表达水平较高(P=0.014)且Vimentin表达水平较低(P=0.011))其他患者,且 E-cadherin和 Vimentin 的表达与患者血清 CA19-9 水平(P=0.048,P=0.009),原发肿瘤浸润深度(T)(P<0.001,P=0.045)和肿瘤淋巴结受累程度(N)(P=0.013,P=0.001)显著相关。2)Kaplan-Meier法单变量生存分析显示,术前血清CA19-9水平正常(P=0.006,P=0.005),服用二甲双胍(P=0.003,P=0.004),原发肿瘤浸润较浅(Tl-3)(P=0.004,P=0.010),淋巴结受累较少(NO)(P<0.001,P<0.001),,E-cadherin 阳性表达(P=0.001,P=0.003)和 Vimentin 阴性表达(P=0.019,P=0.012)的患者具有更长的与无病生存期(DFS)与总生存期(OS)。3)在Cox多变量回归分析中,E-cadherin的表达是与肿瘤无病生存期(DFS)显著相关(P=0.038)的预后因素,而是否服用二甲双胍(P=0.015,P=0.044)以及淋巴结受累程度(P=0.016,P=0.023)是与无病生存期(DFS)与总生存期(OS)均显著相关的预后因素。研究结论1)长期服用二甲双胍或可改善Ⅰ-Ⅲ期结直肠癌合并2型糖尿病患者的生存预后;2)原发肿瘤E-cadherin的高表达以及区域淋巴结无肿瘤转移对于Ⅰ-Ⅲ期结直肠癌合并2型糖尿病患者的生存预后具有积极意义;3)二甲双胍可能对结直肠癌的侵袭播散以及上皮间叶转化(EMT)具有抑制作用。第二部分二甲双胍对结直肠癌上皮间叶转化的调控研究研究目的上皮间叶转化(EMT)在肿瘤的演进、转移及耐药过程中扮演重要角色,由转录因子和miRNA构成的负反馈环结构在EMT的调控过程中起关键作用。Snail/miR-34和Zeb/miR-200负反馈调控环通过环中miRNA和转录因子的相互抑制作用和两个负反馈环之间的上下游调控作用来行使调节功能。经由上游诸多信号通路传递而来的各类EMT刺激信号受到二者的依次调节,并在其他因子如Twist、GRHL2及OVOL2的作用下最终决定了细胞的EMT命运。研究者已发现二甲双胍对多种肿瘤细胞的EMT具有抑制作用,鉴于该药对结直肠癌细胞EMT的抑制作用和具体机制尚不十分明确,本研究旨在检测二甲双胍对结直肠癌上EMT的抑制能力并进一步探索介导该抑制效应的内在药理机制。研究方法上皮间叶转化的细胞模型由结直肠癌细胞系SW480和HCT116经过转化生长因子β诱导构建并加以二甲双胍处理。细胞的生存、迁移及侵袭能力分别由CCK8试剂盒、划痕试验及trans-well试验法测定。反馈环Snail/miR-34和Zeb/miR-200中的各个成分的变化情况以及上皮间叶转化相关标志分子E-cadherin和Vimentin的表达水平由蛋白免疫印迹法、定量PCR以及免疫荧光染色检测。在机制研究中,我们使用siRNA对β-catenin、GRHL2和OVOL2的编码基因基因进行特异性敲除。利用SPSS19.0软件对试验数据进行统计分析,同时引用适用于miRNA-TF系统的Toggle switch模型理论对试验结果做进一步讨论。研究结果1)二甲双胍对人结直肠癌SW480细胞的增殖、迁移和侵袭具有抑制作用:CCK-8试验所得出的OD值显示,二甲双胍对SW480细胞的增殖分裂呈作用浓度梯度(0,1,2,5,10 mM)及暴露时间(0,24,48,72 h)依赖性抑制;在划痕试验中,加入二甲双胍(5 mM)与转化生长因子β(10n g/ml,48 h)诱导的SW480细胞其迁移率显著低于转化生长因子β(10n g/ml,48 h)诱导的SW480对照细胞;trans-well试验显示经由二甲双胍(5 mM)与转化生长因子β(10n g/ml,48 h)共处理的小室中穿膜细胞的数量显著少于仅由转化生长因子β(10n g/ml,48 h)处理的小室。2)二甲双胍对人结直肠癌SW480和HCT116细胞的上皮间叶转化具有抑制作用:蛋白免疫印迹法及定量PCR试验的检测结果显示,二甲双胍(5 mM)与转化生长因子β(10n g/ml,48 h)共处理细胞其EMT的关键标志分子E-cadherin和Vimentin在mRNA与蛋白质的表达水平与单纯转化生长因子p(10n g/ml,48 h)处理的细胞相比有显著差异(二甲双胍使E-cadherin呈较高表达而Vimentin呈较低表达)。3)二甲双胍对EMT负反馈调控环Snail/miR-34和Zeb/miR-200的各个成分发挥不同的调节作用:在转化生长因子β诱导的SW480和HCT116细胞中,二甲双胍使两个负反馈环中对EMT起抑制作用的miRNA分子miR-34和miR-200家族中的miR-200a,miR-200c和miR-429表达升高而使miR-34a的表达降低,同时使系统中促进 EMT 的转录因子 Snail1、Snail2(Slug)、Zeb1(δEF1)和 Zeb2(SIP1)中的Snail1和Zeb1的表达下降。4)二甲双胍诱导上皮间叶转化过程中的结直肠癌细胞SW480和HCT116的上皮特征分子E-cadherin表达信号增强而间叶特征分子Zeb1表达信号减弱,在个体细胞层面则表现为上皮/间叶交界类型细胞的比例上升:在免疫荧光染色中,二甲双胍(5 mM)与转化生长因子β(10n g/ml,48 h)共处理组中E-cadherin与Zeb1呈双阳性表达的细胞比例显著高于转化生长因子β(10n g/ml,48 h)处理组。5)依照 Toggle switch 模型理论,结合 qPCR、western blot及免疫荧光的试验结果,我们推测E-cadherin与Zeb1双阳性细胞比例增加可能系细胞EMT的正向进程受到二甲双胍阻抑所致,而该药对结直肠癌细胞上皮间叶转化(EMT)的负向进程即间叶上皮转化(MET)可能不具有促进作用。6)在特异性敲除转化生长因子β所诱导SW480和HCT116细胞的β-catenin基因后,细胞中 Twist1、Snail1、Zeb1 及核内β-catenin 浓度下降,而 GRHL2 及 OVOL2浓度上升。7)特异性敲除编码GRHL2基因后,SW480和HCT116细胞内的OVOL2水平下调,Zeb1水平上升;敲除编码OVOL2基因的SW480和HCT116细胞均出现GRHL2和Zeb1的增加。8)western blot及免疫荧光均显示:由转化生长因子β所诱导并暴露于二甲双胍(5 mM)的SW480和HCT116细胞中Twist1与核内β-catenin浓度的浓度减少而GRHL2和OVOL2的浓度增加。研究结论1)二甲双胍可以抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;2)二甲双胍可以抑制结直肠癌细胞的上皮间叶转化(EMT),且二甲双胍在该过程对EMT具体发挥促进和抑制两方面作用,而在总体方向上,二甲双胍对EMT的抑制作用大于促进作用;3)二甲双胍或可诱导结直肠癌细胞在EMT过程的上皮/间叶交界(E/M)阶段发生迟滞;4)二甲双胍对结直肠癌EMT的抑制以及对Snail/miR-34和Zeb/miR-200反馈环的调节效应在细胞的个体水平上表现为细胞上皮标志物E-cadherin的上调以及间叶标志物Vimentin的下调,在细胞的群体水平上则反映为上皮/间叶(E/M)交界型细胞比例的增加;5)β-catenin因子参与介导了 TGF-β对结直肠癌细胞EMT的激活信号,而二甲双胍可能通过抑制β-catenin/Twist1/Snail1通路来实现对Snail/miR-34负反馈环中Snail1因子的负向调控;6)GRHL2或可通过间接激活OVOL2或者直接作用于Zeb1来发挥对Zeb/miR-200负反馈环中Zeb1因子的抑制作用,且OVOL2对GRHL2具有一定的负反馈抑制作用。二甲双胍可能通过抑制 β-catenin因子并激活GRHL2/OVOL2/Zeb1通路对Zeb1实现负向调控。