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新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种烈性传染病,发病急,感染率和死亡率高,有时高达100%,它主要危害禽类,特别是鸡。该病在全世界广泛分布,对养殖业造成重创。世界动物卫生组织将该病列为必上报疾病,我国将该病列为一类动物疾病。目前,ND流行又呈现新的特点,为ND防治提出了新的挑战,全面了解ND的发病机制是当前急待解决问题。NDV是副粘病毒科(Paramyxoviridae)禽副粘病毒属(Avulavirus)中禽副粘病毒血清Ⅰ型(Avian paramyxoviruses serotype 1,APMV-1)唯一成员。它为单股、不分节的负链RNA病毒,基因组由15.2kb左右,以3’-NP-P-M-F-HN-L-5’顺序排列,至少编码七种蛋白。其中P基因是唯一能够编码多蛋白的基因,其独特的基因结构和编码方式是NDV重新分属的依据之一。以往NDV致病性蛋白研究主要集中病毒囊膜表面的糖蛋白,特别是F蛋白,但是最近科学家们陆续发现NDV的多个基因产物也参与其中,其中包括源于P基因“RNA编辑”的产物——V蛋白。这些为日益复杂的新城疫防治提供了新的思路。本研究从1997～2007年感染ND病料中分离,纯化得到14株NDV野毒株。同时在近几十年来大量NDV毒株分子流行病学和生物学资料基础上,借助生物信息学等方法对所选毒株的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因和/或磷蛋白(P)基因进行研究。首次探讨了P和HN基因分子进化及其相互关系以及它们与致病性关系,获得了如下进展:一、ND毒株的分离、鉴定和纯化与生物学特性从我国不同地区的鸡和鸭等家禽分离14个毒株,用已知对NDV、禽流感(H5和H9型)等单因子阳性血清作血凝抑制试验(HI)证明均为NDV。同时在细胞培养上完成了蚀斑纯化。经MDT(鸡胚平均死亡时间)、ICPI(1日龄鸡脑内接种致病指数)及IVPI(6周龄鸡静脉致病指数)测定试验,所有NDV野毒株均为强毒。二、NDV分离株P基因的分子进化与致病性关系为研究NDV P基因及其编码蛋白的遗传特性和NDV流行特点以及致病的作用,将分离到毒株的P基因进行克隆、测序,并从GenBank中选取41个国内外不同时期和区域的NDV毒株P基因序列,首次进行P蛋白和V蛋白系统发育与致病性关系研究。氨基酸同源性比较显示:我国NDV毒株与疫苗株及国外毒株比较,P蛋白和V蛋白的同源性低。氨基酸序列分析表明:不同地域分离株P蛋白序列含有独特的氨基酸位点;V蛋白羧基端结构域与NDV侵蚀宿主种属范围和毒力强弱有关。依据P基因系统发育树将历史上NDV分离株分成两个分支,一支以20世纪70年代前北美分离株以及澳大利亚分离株为主,包括Ⅰ～Ⅳ基因型,多以中毒力毒株和弱毒株;另一支由目前世界范围内流行的强毒株构成,包括Ⅴ～Ⅶ基因型。三、NDV分离株HN基因的分子进化与致病性关系将得到的14株NDV毒株的HN基因进行克隆、测序,与GenBank中筛选的29个国内外不同时期和区域NDV毒株的HN基因序列进行HN蛋白系统发育与致病性关系研究。糖基化位点和抗原指数分析表明,与国内传统强毒株相比,国内流行株有一个潜在糖基化位点缺失和两处抗原表位发生变化。氨基酸序列分析表明:NDV不同基因型毒株的HN蛋白序列含有独特的氨基酸位点。HN基因系统发育和氨基酸同源比较表明:NDV分离株可分成两大类,第一大类为最近分离的水禽弱毒株;第二大类又可细分成两大分支,一支以20世纪70年代前北美分离株以及澳大利亚分离株为主,包括Ⅰ～Ⅳ基因型;另一支由目前世界范围内流行的强毒株构成,包括Ⅴ～Ⅶ基因型。四、NDV分离株HN和P基因分子进化及其相关比较将分离到的NDV毒株,分别进行HN和P基因克隆测序,结合15个已发表的国内外不同时期和地域的NDV分离株的HN和P基因,计算毒株间HN和P基因的不同核苷酸和氨基酸片段进化距离,利用统计软件进行了片段间进化距离的方差分析,HN或P基因核苷酸进化距离与毒株分离时间、HN或P基因片段与其全长间以及HN和P基因全长间的相关分析。统计分析显示:NDV HN基因不同核苷酸或氨基酸序列片段变异程度不一样,P基因同样如此;不同毒株间的HN基因片段与其全长间无论是核苷酸还是氨基酸遗传变异高度相关,P基因片段以及HN和P基因全长间同样如此。以上说明,NDV HN和P基因虽以不同的方式进化,但是HN和P基因遗传变异的趋势是相同的。另外,不同毒株与Hert33在分离年代和核苷酸进化距离相关性比较说明,HN和P基因的变异与分离时间有一定的联系。五、NDV P蛋白和V蛋白基因分子进化分析选取55株NDV毒株代表不同地区和时间P基因序列,计算了不同P蛋白和V蛋白氨基酸片段同源性以及核苷酸同义替代率和非同义替代率,以评价不同选择压力对NDV P蛋白和V蛋白基因的影响。结果显示:相同核苷酸经不同重叠阅读框编码得到的氨基酸差异显著,它们的核苷酸替代方式不同。这说明,P基因的重叠阅读框进化是NDV适应不同选择压力的结果,也是存在于NDV准种中的P基因独特空间分布。由相同核苷酸通过不同阅读框编码得到的蛋白质之间关联性分析可知:P基因相同变异较快部分编码得到的P蛋白片段不含有功能性结构域,V蛋白可能含有宿主免疫系统识别的抗原位点。