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目的：筛选肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中异常DNA甲基化的标志物,并探讨其临床应用价值。方法：(1)采用甲基化敏感性限制性内切酶结合荧光定量PCR的方法(Methylation-sensitive restriction enzyme based quantitative PCR, MSRE-qPCR)在188例HCC组织、163例癌旁组织、29例正常肝脏组织和34例血浆样本中检测了酸性磷酸酶1(Acid phosphatase locus 1, ACP1)、骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein 4, BMP4)和睾丸特异性Y样蛋白5(Testis-specific Y-like protein 5, TSPYL5)三个基因的甲基化水平,并采用亚硫酸氢钠克隆测序的方法(Bisulfite genomic sequencing, BGS)在30对HCC组织与癌旁组织中进行了验证。随后分析了这些基因甲基化与临床病理及预后的相关性。(2)在30对HCC及癌旁组织中采用BGS的方法分析了三重基序蛋白58基因(Tripartite motif containing 58, TRIM58)的甲基化水平,对差异最大的区域再采用MSRE-qPCR的方法在181例HCC组织、172例癌旁组织和13例正常肝脏组织进一步分析其甲基化水平。同时采用实时荧光定量PCR的方法检测46对HCC组织及癌旁组织中的TRIM58基因mRNA表达水平。分析DNA甲基化与mRNA表达水平、临床病理及预后之间的相关性。(3)采用基于二代测序的简化基因组亚硫酸氢钠测序(Reduced representation bisulfite sequencing, RRBS)技术分析了3对HCC组织及配对癌旁组织的全基因组甲基化谱,并对所筛选的差异甲基化基因采用基于Illumina MiSeq的亚硫酸氢钠PCR产物测序(Illumina MiSeq sequencing-based bisulfite sequencing PCR, MiSeq-BSP)和MSRE-qPCR的方法在大样本中进行验证,并分析其与临床病理的相关性。结果：(1)HCC组织中ACP1、BMP4和TSPYL5中的甲基化水平显著高于癌旁组织(p<0.0001)及正常肝脏组织(p<0.0001)。TSPYL5的甲基化水平在HCC患者中显著高于健康对照(p=0.001),虽然其甲基化水平很低。ROC曲线分析发现三个基因的甲基化都可以很好的区分癌组织和癌旁组织,曲线下面积分别为0.753,0.785,0.917。此外,BMP4高甲基化患者的无瘤生存期显著缩短(p=0.006),COX回归模型发现BMP4高甲基化是HCC患者无瘤生存期的独立风险因素(p=0.011,HR=3.431,95%CI：1.333-8.833)。(2)HCC组织中TRIM58甲基化平显著高于癌旁组织(p<0.0001)和正常肝脏组织(p<0.0001)。TRIM58高甲基化仅仅出现在HCC组织中(28.18%,51/181),并且与患者的无瘤生存期相关(p=0.047)。此外,TRIM58基因的mRNA水平在HCC组织中显著低于癌旁组织(p<0.0001),且和DNA甲基化水平负相关(p=0.015,rs=-0.260)。(3)基于二代测序的RRBS技术分别在三对样本中发现了3298,5809,18402个差异甲基化区域(Differentially methylated regions, DMR).其中有975个DMR在三对组织样本中都有共同覆盖区域,并涉及396个可注释的基因。采用Miseq-BSP的方法对其中的6个基因(ARHGAP6, BEND4, CAMK2B, DGKE, PTH2R,VIM)进行了验证,发现它们在HCC组织中的甲基化水平显著高于癌旁组织(p<0.0001)。Miseq-BSP与RRBS的结果非常一致,而且以ARHGAP6基因的Spearman相关系数最大(rs=0.851,p=4.67×10-28)。对于ARHGAP6基因,进一步采用MSRE-qPCR的方法在211例HCC组织、193例癌旁组织和20例正常肝脏组织中检测其甲基化水平,发现该基因在HCC组织中甲基化水平显著高于癌旁组织(p<0.0001)和正常肝脏组织(p<0.0001)。此外,ARHGAP6甲基化水平和血清AFP水平之间呈现显著的正相关(p=0.001,rs=0.235)。结论：(1)ACP1、BMP4和TSPYL5甲基化是HCC中的频发事件,可作为HCC的分子病理检测靶标。BMP4高甲基化还可以预测HCC患者术后的复发和转移。(2)HCC中TRIM58高甲基化可能是导致其mRNA表达水平下降的一个原因,而且TRIM58高甲基化可能与HCC患者术后不良预后相关。(3)采用基于二代测序的RRBS技术进行了HCC全基因组甲基化测序,丰富了HCC DNA甲基化谱。发现了新的与HCC相关的差异甲基化基因,并在大样本中进行了验证。