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目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)已成为21世纪威胁人类生命健康的慢性重大疾病之一。糖尿病大血管并发症是2型糖尿病致死致残的首要原因,据统计超过70%的DM患者死于糖尿病血管病变。近年来,大量证据表明糖尿病大血管病变与过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-)产生过多有关。高血糖可诱导血管内皮诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达增多,一氧化氮(NO)生成量明显增多,过量生成的NO具有细胞毒性作用。其次,过量生成的NO还可与超氧阴离子( )迅速结合生成氧化作用更强的ONOO-。ONOO-可使蛋白质酪氨酸残基或游离酪氨酸发生硝基化反应,形成最终产物硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT)。蛋白质硝基化后能诱导酶活性的丧失、细胞的坏死和凋亡。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)为二硫氨基酸酯,因其分子所含巯基(thiol)结构,具有抗氧化及金属螯合作用,可以特异性抑制NF-κB活性,有效抑制氧化损伤所致的NF-κB活性的表达,减少多种炎症介质的表达,从而改善内皮细胞功能。已有多项研究表明,PDTC可降低糖尿病大鼠血糖水平。本实验研究目的在于观察链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的高脂高糖喂养的2型糖尿病大鼠模型中主动脉血管内皮iNOS表达、NT生成的变化,并应用PDTC进行干预,观察其整体降糖作用及对主动脉血管内皮iNOS表达及NT生成的影响,为预防和延缓糖尿病大血管病变提供理论依据和有效治疗方法。方法:参照Reed等方法建立2型糖尿病大鼠模型。8周龄健康雄性Wistar大鼠37只,体重180-210g,由河北医科大学动物实验中心提供(许可证号(冀)2008-1-003,批号:901010)。随机分为正常对照组(NC组)12只和高脂饮食组(HFD组)25只,NC组喂以标准大鼠饲料,HFD组喂以高脂高糖饲料,8周后HFD组经口服葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验证实出现胰岛素抵抗时,给予一次性腹腔注射链脲佐菌素27mg/kg,NC组大鼠给予等体积柠檬酸缓冲液腹腔注射,72h后,尾静脉取血测定空腹血糖≥7.8mmol/L者为2型糖尿病大鼠。再将HFD组的糖尿病大鼠随机分为糖尿病组(DM组)和PDTC治疗组(PDTC组)。PDTC治疗组每日腹腔注射PDTC 50mg/kg,NC组和DM组每日给予等体积的蒸馏水腹腔注射。实验末,PDTC治疗组1只大鼠因行胰岛素耐量时出现低血糖而死亡,正常对照组(NC组)大鼠12只,糖尿病组(DM组)12只,PDTC治疗组(PDTC组)大鼠剩余12只。每组大鼠于实验开始、注射STZ前及实验结束时均称重、取血。每组大鼠于注射STZ之前和注射STZ10天后做口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素耐量试验(ITT)。大鼠自采血前一日20:00起禁食,实验日8:00分别从内眦静脉取血3ml,分离血清,用于各指标的检测。PDTC治疗1周末,断头处死动物,分别留取胸主动脉检测各指标。1.血糖、胰岛素的测定血糖采用葡萄糖氧化酶法测定。胰岛素采用ELISA法测定。应用稳态模型(Homeoestasis Model Assessment,HOMA)及胰岛素抵抗指数(Insulin Sensitivity Index,ISI)评价胰岛素抵抗的程度。2.口服葡萄糖耐量试验(OGTT)、胰岛素耐量试验(ITT)OGTT以2g/kg葡萄糖灌胃,分别测定0、30min、60min、90min、120min血糖水平。ITT以1IU/kg生物合成人胰岛素腹腔注射,分别测0、15min、30min、60min、90min血糖水平。3.血脂的测定使用全自动生化分析仪测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平,采用Cu2+比色法测定游离脂肪酸(FFA)水平。4. SOD、GSH-PX、MDA的测定制备组织匀浆,低温离心机3000r/min离心10-15min,留上清弃沉淀,然后严格按照试剂盒说明分别测定SOD、GSH-PX、MDA。5.各组大鼠主动脉组织学变化各组大鼠主动脉组织分别进行石蜡切片,常规HE染色,在光镜下观察主动脉组织形态学变化。6.免疫组化观察各组大鼠主动脉内皮iNOS、NT的表达选用各组大鼠主动脉组织分别进行石蜡切片,经常规免疫组化染色,在光镜下观察主动脉内皮细胞iNOS、NT的含量变化。7.免疫荧光观察各组大鼠主动脉内皮iNOS、NT的表达常规方法制备大鼠主动脉石蜡切片,行免疫荧光染色,在荧光显微镜下观察主动脉内皮细胞iNOS、NT的含量变化。8.统计学处理所有数据均用SPSS13.0软件处理。计量资料以x±s表示,组间差异用两样本均数的t检验进行比较。显著性用P值表示,P<0.05为差异有显著性。结果:1. STZ造模前两组大鼠的比较1.1两组大鼠空腹血糖和体重的比较实验开始时,大鼠随机分为正常对照组大鼠(NC组)和高脂饮食组(HFD组),两组大鼠体重、空腹血糖均无统计学差异。大鼠喂养8周后,HFD组大鼠体重(361.92±19.22g)明显高于NC组大鼠(313.17±19.95g),差异具有极显著性(P<0.01);两组空腹血糖仍无统计学差异。1.2两组大鼠胰岛素、HOMA-IR和ISI的比较大鼠喂养8周后,HFD组大鼠胰岛素水平(18.01±2.63μIU/ml)明显高于NC组大鼠(10.67±0.83μIU/ml),差异具有显著性(P<0.05);HFD组大鼠HOMA-IR(1.22±0.17)明显高于NC组大鼠(0.68±0.09),差异具有显著性(P<0.05);HFD组大鼠ISI(-4.43±0.17)明显低于NC组大鼠(-3.79±0.09),差异具有显著性(P<0.05)。1.3两组大鼠血脂的比较大鼠喂养8周后,HFD组大鼠TC(8.79±1.83mmol/L)明显高于NC组(2.18±0.11mmol/L),有显著性差异(P<0.05);HFD组大鼠TG(1.12±0.31mmol/L)明显高于NC组(0.66±0.07mmol/L),有显著性差异(P<0.05);HFD组大鼠LDL(1.72±0.28mmol/L)明显高于NC组(1.10±0.07mmol/L),有显著性差异(P<0.05);HFD组大鼠FFA(1.82±0.14mEq/L)明显高于NC组(1.27±0.13mEq/L),有显著性差异(P<0.05)。1.4两组大鼠OGTT、胰岛素耐量试验的比较大鼠喂养8周后,行OGTT结果示:NC组大鼠口服葡萄糖后30min血糖达高峰;HFD组大鼠,90min血糖达高峰,各时间点血糖水平较NC组明显升高,其中90min、120min二个时间点有显著性差异(P<0.05)。胰岛素耐量结果示:HFD组大鼠腹腔注射胰岛素后各时间点血糖明显高于NC组,其中15min、60min、90min三个时间点有显著性差异(P<0.05)。2. STZ造模后各组大鼠的比较2.1各组大鼠血糖的比较注射STZ 72h后,HFD组大鼠空腹血糖(26.16±3.38mmol/L)明显高于NC组(4.41±0.56mmol/L),有极显著性差异(P<0.01)(Table 1)。PDTC治疗1周后,DM组大鼠空腹血糖(26.55±2.90mmol/L)明显高于NC组(5.58±0.43mmol/L),有极显著性差异(P<0.01);PDTC治疗组大鼠空腹血糖(11.55±2.89mmol/L)明显低于DM组,有极显著性差异(P<0.01),但仍高于NC组(P<0.05)。2.2各组大鼠OGTT、胰岛素耐量的比较PDTC治疗1周后,行OGTT结果示:PDTC治疗组各时间点血糖均明显低于DM组,其中120min时间点有显著性差异(P<0.05)。胰岛素耐量结果示:PDTC治疗组各时间点血糖明显低于DM组,其中0、15min时间点有显著性差异(P<0.05)。2.3各组大鼠SOD、GSH-PX、MDA活力的比较PDTC治疗1周后,DM组大鼠的SOD活力(71.5±3.01)明显低于NC组(188.73±1.49),有极显著性差异(P<0.01),PDTC治疗组大鼠的SOD活力(161.00±2.55)明显高于DM组,有极显著性差异(P<0.01)。DM组大鼠的GSH-PX活力( 1667.32±81.16 )明显低于NC组(2437.51±259.19),有显著性差异(P<0.05),PDTC治疗组大鼠的GSH-PX活力(2392.78±174.01)明显高于DM组,有显著性差异(P<0.05)。DM组大鼠的MDA含量(5.10±1.01)明显高于NC组(0.89±0.17),有显著性差异(P<0.05);PDTC治疗组大鼠的MDA含量(1.60±0.64)明显低于DM组,有显著性差异(P<0.05)。2.4各组大鼠主动脉组织学变化经HE染色,光镜下观察显示,NC组动脉血管壁光滑,内皮完整,平滑肌排列整齐,细胞轮廓清晰;DM组动脉血管内膜中断,内皮间断脱失,平滑肌排列紊乱,间质水肿;PDTC治疗组内膜表面较光滑,内皮缺损及间质水肿较DM组明显减轻。2.5免疫组化观察各组大鼠主动脉内皮iNOS、NT的表达iNOS在DM组大鼠主动脉内皮表达水平明显高于NC组;在PDTC治疗组大鼠主动脉内皮表达水平明显低于DM组。NT在DM组大鼠主动脉内皮表达水平明显高于NC组;在PDTC治疗组大鼠主动脉内皮表达水平明显低于DM组。2.6免疫荧光观察各组大鼠主动脉内皮iNOS、NT的表达DM组大鼠主动脉内皮可见绿色iNOS荧光信号,荧光强度明显高于NC组;PDTC治疗组大鼠主动脉内皮iNOS荧光强度较DM组明显减低。DM组大鼠主动脉内皮可见绿色NT荧光信号,荧光强度明显高于NC组;PDTC治疗组大鼠主动脉内皮NT荧光强度较DM组明显减低。结论:1通过高脂高糖饮食及小剂量链脲佐菌素腹腔注射,可成功制备2型糖尿病大鼠模型,并且出现糖尿病大鼠大血管早期病理改变。2 2型糖尿病大鼠大血管氧化防御受损,氧化还原严重失衡,同时血管内皮细胞iNOS表达、NT生成明显增多,表明氧化应激损伤在糖尿病大血管病变的发生中起重要作用。3 PDTC不仅具有降血糖作用,而且可以减少iNOS的表达,进而减少ONOO-及NT的产生,延缓了糖尿病大血管并发症的发生。早期应用PDTC可预防2型糖尿病因“代谢记忆”所致的大血管损伤。