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细胞信号传导网络控制细胞内各种基本生理过程,调控细胞行为、决定细胞命运。开发针对细胞信号传导的调控策略是实现用户定义细胞行为的重要切入方向。当前的研究中,调控细胞信号传导依赖于改造细胞受体,多数策略是基于对细胞膜表面受体进行重新编码或修饰。环境中存在信号分子时,改造后的受体发生配体介导的激活响应,通过特定细胞信号传导途径产生下游信号,最终调节和控制细胞行为。针对细胞受体的工程改造有两类方法。一,基于对遗传物质的改造。这类方法能够重新编码受体蛋白、赋予其新的功能,但遗传改造目前存在一些难点:蛋白质工程繁琐而复杂,很难精准控制蛋白质的高级结构折叠,很难构建性质稳定的响应模块等。二,基于DNA对细胞进行非遗传改造。这是一类操作简易、生物安全、功能强大的调控方法。但目前的改造手段都依赖于核酸适配体与受体的特异性结合,因而受到结合亲和力、细胞受体类型、受体表达水平等方面的限制。为了解决这样的问题,需要开发拓展基于非遗传方法的通用型改造策略。本论文构建了一种基于蛋白核酸嵌合物的脂质囊泡PDV（protein-DNA chimera vesicle）,其通过融合的方式对细胞进行非遗传改造,将功能分子修饰到细胞膜上,在此基础上进行了细胞信号传导调控的初步探索。PDV与细胞的融合改造不受细胞类型限制,具有通用性。功能分子蛋白核酸嵌合物由DNA和蛋白通过共价连接而成,既具有蛋白质的多功能特性又具有DNA可编程的优点,因而能够基于合理设计扩展PDV的调控功能。本文基于基因工程进行多功能融合蛋白的模块化设计,引入DNA动态链置换实现对目标物的响应,通过荧光信号在细胞内转位初步实现信号的检测。论文具体的研究内容如下:1、融合蛋白EGFP-DCVm、NLS-EGFP-DCVm的体外表达和性质研究。本章在课题组已有研究基础上,通过基因工程构建两种融合蛋白EGFP-DCVm、NLS-EGFP-DCVm,并进行体外诱导表达和纯化,为后续研究提供工具基础。其中鸭圆环病毒蛋白（duck circovirus,DCV）具有独特的限制性内切酶、连接酶活性,能够与特定序列的DNA共价连接,形成稳定的蛋白核酸嵌合物。EGFP（enhanced green fluorescent protein）是增强型绿色荧光蛋白,性质稳定,常作为荧光报告基因。核定位序列NLS（nuclear localization sequence）是一段特殊肽段,能够介导蛋白质转运进细胞核。基于以上性质,为了扩展蛋白功能,我们构建了融合蛋白NLS-EGFP-DCVm。为提高目的蛋白的表达量和纯度,对NLS-EGFP-DCVm体外诱导表达的条件进行了探究。性质研究发现两种融合蛋白（1）都具有EGFP的光学性质;（2）都保留了DCVm与特定DNA序列共价连接的活性。进一步评估了所表达的蛋白在不同二价金属离子催化、不同反应时间条件下与DNA共价连接的情况,发现其连接效率都能达到80%以上。2、基于蛋白核酸嵌合物的脂质囊泡PDV的构建和性能优化。本章基于蛋白核酸嵌合物开发了一种脂质囊泡PDV。我们首先通过凝胶电泳分析验证了蛋白核酸嵌合物A-D-proteinEGFP-DCVm的组装。其中A-D是由两条部分互补的DNA组成的杂交链,D链一端带有DCV的识别序列,可以与EGFP-DCVm共价连接形成嵌合物,而A链的5′修饰有脂质亲和的胆固醇,使嵌合物可以在合成过程中插入到脂质膜中。然后我们通过经典水合法构建脂质囊泡PDV。DLS分析所合成的脂质囊泡的直径为200 nm左右。利用蛋白核酸嵌合物中的绿色荧光标记,通过荧光成像证明该囊泡不仅能够与细胞发生融合,以此将蛋白核酸嵌合物锚定在细胞膜上,而且蛋白核酸嵌合物均匀地分散在细胞膜上。随后我们针对PDV与细胞的融合效果,进行了PDV浓度和反应时间的条件优化,验证了PDV与不同类型的细胞都能发生融合。蛋白核酸嵌合物在融合细胞能保持长时间稳定（10小时）,且不发生细胞之间的串扰。细胞毒性验证表明PDV具有很好的生物相容性。3、细胞膜信号响应模块的功能初步探索。本章基于蛋白核酸嵌合物的组成特性,引入DNA动态链置换设计,进行细胞膜信号响应模块功能的初步探索。基于嵌合物A-D-proteinEGFP-DCVm制备得到PDV1;基于嵌合物A-D-proteinNLS-EGFP-DCVm制备得到PDV2。在对细胞完成融合改造后,以Lipo8000负载的方式向细胞内输入人工信号链Target,其在细胞膜内与蛋白核酸嵌合物的核酸部分发生toehold介导的链置换,从膜上释放蛋白核酸嵌合物,因此产生可视化的荧光信号胞内转位,使细胞对所输入的人工信号发生响应。我们首先通过凝胶电泳分析验证了DNA链置换反应能够在体外进行,然后对人工信号链Target在细胞中的输入递送进行了浓度和时间的优化,最后通过成像对两种PDV改造后细胞对人工信号的响应情况进行分析。根据蛋白设计的不同,细胞的信号响应可以表现为荧光由细胞膜转移到细胞质（由PDV1调控）,也能实现由细胞膜转移到细胞核（由PDV2调控）。