研究目的：钾通道为目前发现亚型最多、结构与功能最为复杂的一类离子通道,因其选择性通透钾离子特性而得名。钾通道广泛分布于中枢神经系统,同时外周如骨骼肌、心脏、血管、气管及腺体细胞等也有表达。生理功能上,钾通道主要参与维持细胞膜电位,调节可兴奋细胞的兴奋性,以及平滑肌的舒缩等过程。根据结构的不同,钾通道被分为四大类：电压门控钾通道(Kv)、钙激活的钾通道(Kca2+)、内向整流钾通道(Kir)和双孔钾通道(K2P)。在结构上,K2P家族区别于传统钾通道最重要的特征是其同源二聚体的组装形式,这与该家族成员每个亚基拥有独特的四个跨膜片段(M1-M4)和两个孔区(P1,P2)结构域相关,而传统钾通道为同源四聚体。TREK-2 (TWIK Related K+ channel 2,又称K2P 10.1)为K2P家族成员之一,高表达于中枢神经系统,在外周神经系统和外周组织也有分布。生理功能上,TREK-2主要参与维持静息膜电位、调节兴奋性、感觉传导、调节细胞体积、代谢调节和凋亡。通过调节细胞兴奋性,TREK-2参与众多生理、病理和药理作用进程。作为细胞兴奋性的关键调控因子,TREK-2的功能受到大量生理和化学信号的调控,如神经递质、G蛋白耦联受体、机械张力、胞内外pH、温度、多不饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸盐、挥发性全身麻醉剂以及神经保护剂等。在传统钾通道的离子电导通路上,从内到外依次排列着内门和外门,(又称C-型门,或失活门)。离子通道调控的门控机制是指离子电导通路通过移动特定的门控元件,或变化空间构象发生来实现对离子流入或流出的调控。目前认为,钾通道的门控机制可分为三种：第一,外门门控机制。目前的研究表明,细胞外液钾离子浓度从生理水平更换为无钾离子时,通道外门的构象从通导状态转变为非通导状态；另外,质子化位于外门的pH感受器促进外门坍塌。这些机制类似于电压门控钾通道的C-型失活(C-type inactivation)。由于上述两种机制均导致外门构象发生变化,因此将它们归为一类,统称外门门控机制。第二,内门门控机制。内门由跨膜螺旋束(helices bundle)形成,其调控关键元件为位于这些螺旋束中的甘氨酸铰链(glycine hinge),介导螺旋束运动从而控制K+的流动。第三,N-型失活机制(N-type inactivation),为大多数Kv通道所使用。通道可以被通道本身的部分N末端(Nt)或者辅助的β亚基所阻断,从而使通道快速关闭。研究表明,内门和外门的活动并不是完全独立的：外门通过其构象变化发挥作用,而内门运动可诱导离子选择器构象发生变化,即内门运动与外门活动相耦联。通过对电压门控钾通道Shaker和果蝇双孔钾通道KCNKO嵌合体进行研究,证实此嵌合体也存在内门和外门,它们呈正协同耦联,完全相反于一些电压门控钾通道的负协同耦联。但是,由于此嵌合体的孔区仍然为同源四聚体,并不能真实反映K2P通道的双二聚体(dimer of dimers)孔区结构。因此,迄今为止,关于K2P通道中内门和外门是否存在耦联关系仍属未知。另外,众多研究表明钾通道的活性除了受到大量生理和物理化学信号的调控,也受通道本身转录水平和选择性翻译起始(alternative translation initiation,ATI)机制的影响。选择性翻译起始(ATI)机制为蛋白翻译水平调控机制之一,无论在真核生物或原核生物中,此机制均为增加蛋白分子多样性的重要机制。越来越多的研究表明,由ATI机制产生的不同蛋白亚型可表现为功能的多样性,比如在亚细胞定位方面,生长因子、转录因子、激素受体、蛋白激酶和一些离子通道的功能方面等。在TREK-2的N末端(Nt)存在三个翻译起始位点,根据Kozak规则,第二个为最佳位点,而并非第一个。因此,核糖体扫描时可能漏掉第一个翻译起始位点甚至前两个,这将导致同一种TREK-2的mRNA可产生长、中、短三种不同长度Nt亚型。研究表明,这三种亚型对K+和Na+的选择性相似,而电导存在显著差异。那么,这种电导差异是否与离子选择器构象相关呢?Nt是否也影响其离子选择器的构象?这些仍需进一步探讨。综上所述,虽然对于钾通道的门控机制研究取得了不少进展,然而对于双孔钾通道,特别是TREK-2的门控机制研究甚少,仍然存在一些基本科学问题等待回答。比如,TREK-2的第二和第四跨膜片段同样存在甘氨酸铰链,但此甘氨酸铰链是否在内门活动中发挥功能?TREK-2通道中内门和外门是否存在耦联关系?TREK-2的C末端(Ct)是否影响门控机制及其可能的方式如何?TREK-2的Nt是否影响其离子选择器的构象?基于以上现状,本研究应用TREK-2激动剂2-氨基乙基联苯基硼酸酯(2-Aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)、胞外酸(pH。)和Ba2+作为工具,结合分子生物学和双电极电压钳技术,探讨以上几点未知问题,以期丰富TREK-2的门控机制理论。研究方法：(1)质粒构建,通道表达于非洲爪蟾卵母细胞中和双电极电压钳记录电流构建可以在非洲爪蟾卵母细胞中高表达的pGH-19-TREK-2和pGH-19-TREK-1重组质粒。根据研究目的的不同,应用PCR技术构建一系列结构不同的突变体、缺失体、嵌合体和串联二聚体,其中串联体的两个亚基应用一个可灵活变动的多肽连接,多肽氨基酸序列为AAAGSGGSGGSTGGSSGSSGS,以上各种突变体、缺失体、嵌合体和串联体质粒均经过DNA测序,结果与数据库比对以保证DNA序列正确。以上各种质粒应用Xho I限制性内切酶酶切线性化,然后体外转录成cRNA, cRNA显微注射至非洲爪蟾卵母细胞,培养1-3天后,应用双电极电压钳技术,将细胞膜电位钳制在-80 mV,应用Ramp模式从-120mV去极化至+60 mV,时间150 ms,记录电流,观察它们在生理钾离子浓度(5mM)或者其他钾离子浓度(0 mM、20 mM或40 mM)条件下,对胞外给予不同浓度的2-APB或Ba2+的反应,以及它们对不同pH细胞外液的反应。研究结果:一、TREK-2内门对外门的调控作用(一)2-APB激活TREK-2通道的机制研究1)2-APB通过作用于TREK-2的C末端发挥其激活功能。根据文献报道,2-APB激活TREK-1和TREK-2通道的程度有着非常显著的差异,我们推测两种通道分子蛋白序列的低同源区可能导致了这种差异,同时与2-APB激活TREK-2密切相关。根据序列比对结果,位于胞内区的N末端(N-terminus, Nt)和C末端(C-terminus, Ct)为两条序列之间的低同源区。我们的实验发现,TREK-2的Nt缺失体对2-APB的敏感性与野生型相似,从而排除了Nt在该激活过程中的作用。交换两种通道的Ct可完全交换2-APB敏感性：即连接TREK-1的Ct到TREK-2相应位置可显著降低TREK-2对2-APB的敏感性,连接TREK-2的Ct至TREK-1相应位置则显著提高TREK-1对2-APB的敏感性,表明2-APB通过作用于TREK-2的Ct发挥其激活功能。2)C末端近侧区为2-APB与TREK-2相互作用所必需,而远侧区发挥负调控作用。根据序列比对结果,TREK-1和TREK-2的Ct近侧区(proximal Ct, pCt)相对保守,而远侧区(distal Ct, dCt)同源性较低。然而,缺失远侧区导致TREK-2对2-APB的敏感性显著上调,表明pCt为2-APB发挥功能所必需,而dCt则起着负性调节作用。3)位于C末端近侧区的368位组氨酸为2-APB的结合所必需。为进一步寻找2-APB作用的关键氨基酸,我们将TREK-2 pCt区内相对于TREK-1的非保守氨基酸(共7个)突变成TREK-1相应的氨基酸,并检测它们对2-APB的敏感性。结果发现,只有H368Y表现为敏感性下调,表明第368位组氨酸在2-APB开放TREK-2的过程中发挥了必不可少的作用。为鉴定该氨基酸涉及2-APB的结合还是通道的门控过程(即门控的公共元件),我们检测了H368Y对胞外pH值(pHo)变化的反应。结果表明,该突变体的行为与野生型相似。已知pHo变化通过引发外门构象变化调控通道活性,因此该氨基酸并不影响外门的功能,表明该氨基酸可能直接参与2-APB对TREK-2的结合。4)2-APB通过促进TREK-2内门开放发挥其激活通道功能。通过改变胞外钾离子浓度诱导TREK-2通道外门构象发生变化,并不影响2-APB的激活功能。另一方面,TREK-2的S4位点(第四个钾离子结合位点,位于外门的最内侧)突变体T172S和T281S对2-APB的敏感性也与野生型的相似。这些结果说明改变TREK-2的外门构象并不影响2-APB对TREK-2通道的开放,提示2-APB的作用与外门构象无关。第四跨膜区(M4)的甘氨酸铰链突变体(G312A)对2-APB的敏感性显著下调,而M4为内门的组成分,表明2-APB通过作用于内门激活TREK-2通道。(二) TREK-2的门控机制特点探索1)在甘氨酸铰链水平,两个亚基在TREK-2内门开放过程中呈协同合作(cooperative)方式。为鉴定组成成熟TREK-2通道的两个亚基在2-APB诱导的内门开放过程中呈独立或者合作方式,我们构建了含有所有可能甘氨酸铰链突变组合的串联二聚体(含有两个M2甘氨酸铰链突变的除外,因为没有功能性通道表达),并检测它们对2-APB的敏感性。结果发现,单亚基突变体(共6种)对2-APB的敏感性与野生型串联分子(WT-WT)相似；双亚基突变体(共5种)对2-APB的敏感性下调。这些结果表明在甘氨酸铰链介导的内门活动中,两个亚基间并不是完全独立的,野生型亚基可完全补偿突变型亚基的功能,提示两个亚基间存在相互协同合作的关系。2)外门构象的变化依赖甘氨酸铰链的活动。为确定外门构象变化是否与甘氨酸铰链活动相偶联,我们检测了上述甘氨酸突变体对pH。变化的反应。结果表明,与对2-APB的反应极为相似：单亚基突变体对pH0的反应与野生型相当；而双亚基突变体中,除了G196A-G312A和G312A-G196A与野生型没有明显区别(对2-APB的反应也只与野生型有轻微差别),其它的均表现为敏感性显著下降。这些结果提示pHo引起的外门构象变化过程中,甘氨酸铰链介导的内门活动控制着外门活动,同时亚基间仍然相互合作。3)C末端近侧区参与对离子选择器构象的调控。根据以上结果,C末端近侧区与2-APB对TREK-2的结合密切相关,由于该区段在其它钾通道中通常为多种信号整合的关键结构域,我们也检测了该区段在TREK-2其它门控模型中的可能调控作用。首先,该区段缺失体表现为对2-APB的敏感性显著下调,与预期相符。另外,ΔpCt对pHo的敏感性也表现为显著降低,提示C末端近侧区也参与对离子选择器构象的调控,同时表明该区段为内门和离子选择器的公共调控元件。4)C末端以亚基协同和顺式的方式调控TREK-2的内门和外门。综上所述,C末端在TREK-2的整个门控机制中发挥了重要的作用,但其调控的模式未知。为解决这个问题,我们首先构建了单亚基C末端缺失体(串联二聚体WT-△Ct和ACt-WT),并检测它们对2-APB和pHo的反应。结果表明,只保留一个亚基的C末端并不影响TREK-2对2-APB和pHo的敏感性,提示C末端对内门和离子选择器的调控为亚基协同方式。其次,进一步突变上述串联二聚体中野生型分子的甘氨酸铰链(△Ct-G196AG312A)引起对2-APB和pHo的敏感性显著下调,表明位于不同亚基上的正常的C末端和甘氨酸铰链的功能并不能相互补偿,提示C末端调节内门和离子选择器的方式为顺式机制。5)内门活动调控离子选择器构象的变化。总结以上数据,我们发现在涉及甘氨酸铰链和C末端的突变体中,对2-APB不敏感的也表现为对pHo不敏感,反之亦然。既然甘氨酸铰链和C末端近侧区为控制内门活动的关键元件,同时根据TREK-2的结构特点,我们认为,在TREK-2的门控过程中,内门起主导作用,离子选择器构象变化完全受控于内门。二、选择性翻译起始(alternative translational initiation, ATI)产生的三个TREK-2亚型拥有相似的离子选择器构象已知Ba2+为检测离子选择器构象变化的有效工具。由于离子选择器序列在大多数钾通道中保守,我们检测了TREK-2对Ba2+的敏感性。结果如下：1)Ba2+呈浓度依赖和时间依赖的方式抑制TREK-2电流,而且这种抑制作用受到细胞外液钾离子浓度变化的显著影响；外门内S4位点(第四个钾离子结合位点)突变体T172S和T281S对Ba2+的敏感性显著下降。以上结果表明Ba2+通过与钾离子在S4位点的竞争结合发挥其对通道电流的抑制作用,为探测S4位点构象变化的有效工具。2)在生理浓度K+条件下,T172S和T281S对pHo的反应与WT相似,表明pHo引发的离子选择器构象变化并不涉及S4位点,而可能位于外侧。3)Ba2+对ATI机制产生的三个TREK-2亚型的抑制率、结合和解离速率均相似,表明这些亚型与野生型在离子选择器的最内侧(S4位点)构象相似；同时,这三个亚型对pHo的反应也没有显著差异,表明这些亚型在离子选择器的外侧构象也相似。以上数据说明ATI机制产生的三种亚型拥有相似的离子选择器构象。另外,由于ATI产生的三种亚型拥有不同长度的N末端(Nt),因此,以上结果也表明TREK-2的Nt可能不参与离子选择器构象的调节。研究结论：(1)本研究以同源性较高的TREK-1和TREK-2通道对2-APB的敏感相差悬殊为线索,对该化合物刺激TREK-2活性的机制以及TREK-2的门控特点进行了探讨。首先,我们发现该化合物主要通过与位于C末端近侧区的第368位组氨酸结合,并促进内门的开放而发挥其激活活性。随后,我们以2-APB和pHo分别作为研究内门和外门活动的工具,发现甘氨酸铰链和C末端(尤其是近侧区)为控制内门和离子选择器活动的重要元件,通道的两个亚基在门控过程中相互协同,而C末端和甘氨酸铰链以顺式方式(即位于同一个亚基的两种元件)相互调控。在TREK-2的门控过程中,内门处于主导地位,外门构象的变化完全依赖内门的活动。(2)Ba2+通过与钾离子竞争结合于位于离子选择器内的第四个钾离子结合位点而抑制TREK-2通道的开放。以Ba2+和pH0为工具,我们发现由选择性翻译起始机制产生的三种亚型拥有相似的离子选择器构象。我们的研究进一步丰富了双孔钾通道的门控机制内容,可为相关靶标的药物设计与开发提供理论指导。同时,2-APB、Ba2+和pHo可作为研究TREK-2通道或其它钾通道结构与功能的有效工具。