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象草(Pennisetum purpureum)是禾本科狼尾草属的多年生大型草本植物,是优良饲用牧草及新型能源植物。但其体内过高的木质素含量限制了象草的开发与利用。所以,利用基因工程的方法,降低象草木质素含量或改变木质素组成对象草的利用具有重要意义。MYB转录因子及肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoy-CoA Reductase,CCR)基因启动子都参与了木质素的生物合成调控。本文研究了象草抑制型PpMYB4转录因子(登录号为:KU612217)与PpCCR启动子互作关系,以期为象草的木质化改良工作奠定基础。主要的研究结果如下:(1)构建了一个以LUC以及REN为报告基因的双荧光素酶报告检测PpCCRPro-LUC载体和PpMYB4-SK载体,通过瞬转烟草后测定荧光值发现PpMYB4与PpCCR启动子(PpCCRPro)有明显的互作,且能抑制了PpCCRPro的活性。(2)通过构建PpCCRPro启动GUS报告基因的表达载体PpCCRPro-GUS和pBA-PpMYB4载体,并瞬转烟草,测定GUS酶活发现,PpMYB4与PpCCRPro有明显的互作,且抑制了PpCCRPro的活性。(3)通过带有His标签蛋白基因的表达载体p ET-PpMYB4和PpCCR基因启动子探针进行凝胶迁移率实验(Electrophoretic mobility shift assay EMSA)发现PpMYB4可以结合到PpCCRPro上的AC-I元件。(4)构建了带有HA标签蛋白的表达载体HA-pBA002-PpMYB4进行染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)发现Pp MYB4转录因子可以与木质素合成相关基因(4CL、CCoAOMT、CCR、CAD)启动子在烟草体内发生相互作用;而且结果表明PpMYB4与CAD基因启动子结合能力是最强的。(5)构建了以PpCCRPro启动PpMYB4的表达载体PpCCRPro-PpMYB4,并且通过叶盘法转化烟草,最终得到3个株系转基因烟草。与野生型烟草相比转基因烟草植株出现了明显矮化以及叶片卷曲等不正常生长。同时,转基因烟草茎秆以及叶柄木质素含量均低于野生型,OE3茎秆及叶柄木质素含量比野生型分别降低了35.31%和36.54%。(6)通过qPCR对PpCCRPro-PpMYB4转基因植株以及野生型植株木质素合成途径中关键酶基因(4CL、CCoAOMT、CCR、CAD)进行检测,发现这些基因的相对表达量均低于野生型,且CCR的表达量极显著低于野生型。该结果说明PpCCRPro这一组织特异性启动子促使PpMYB4过量表达,抑制了下游4CL、CCoAOMT、CCR和CAD基因的表达,导致转基因烟草的木质素含量显著下降。此外,用100μmol/L ABA、MeJA、GA处理转基因植株后发现,随着处理时间加长木质素合成相关基因(4CL、CCoAOMT、CCR、CAD)表达量均先增后减。