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Notch信号通路在生物的生命活动中发挥着重要功能。近年来,其在骨发育及再生中的作用受到国内外越来越多的重视。目前研究表明,除经典的膜蛋白配体(Jagged1,Jagged2,DLL1,DLL3,DLL4)外,Notch信号通路还有一种分泌型配体存在:CCN3,又称肾母细胞瘤过表达因子(nephroblastoma overexpressed,NOV),并在各种生命活动中起到不可或缺的作用。我们的前期研究结果表明,DLL1(经典的膜蛋白配体)激活的Notch信号可促进骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)诱导的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的成骨分化,这一过程是通过BMP信号通路进行的,而CCN3抑制MSCs的成骨分化。那么,CCN3作为Notch信号的一种分泌型配体,是如何与膜蛋白配体DLL1分别发挥不同作用,影响MSCs成骨分化的呢?二者对于MSCs的细胞增殖又起到怎样的作用呢?本研究拟针对上述问题,探讨CCN3协同DLL1调控MSCs成骨分化与增殖的机制,寻找CCN3及相关蛋白在骨组织工程中的临床应用潜能。第一部分:目的:探讨CCN3协同DLL1调控MSCs成骨分化的机制。方法:通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测早期成骨指标ALP的表达;免疫组化检测成骨指标骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)的表达;qRT-PCR、ELISA实验检测CCN3的表达;qRT-PCR检测高度同源的腺病毒E1A相关的300 kDa蛋白(p300)的表达;qRT-PCR、Western Blot检测Runx2的表达;Western Blot检测组蛋白3(Histone 3,H3)、组蛋白3第9位赖氨酸残基(Histone3 lysine 9,H3K9)的乙酰化水平。结果:DLL1抑制CCN3在细胞外基质中的表达;BMP9促进CCN3的表达;低浓度的CCN3能促进MSCs的成骨分化,但高浓度的CCN3抑制MSCs的成骨分化;高浓度的CCN3能抑制p300的表达,降低组蛋白乙酰化水平,抑制Runx2的表达;而DLL1上调p300的表达,升高组蛋白乙酰化水平,促进Runx2的表达。结论:Notch信号通路两种不同的配体CCN3(分泌型配体)与DLL1(膜配体)通过与BMP9相互作用,影响组蛋白乙酰化水平,协同调控MSCs成骨分化。不同浓度的CCN3在其中发挥着截然不同的作用。第二部分:目的:研究CCN3和DLL1对MSCs增殖的影响及机制。方法:通过CCK-8、流式细胞术检测两种Notch配体对MSCs增殖的影响;从细胞分化程度、细胞密度、MAPK信号通路等多方面探讨其可能机制。结果:高浓度CCN3对MSCs的细胞增殖发挥明显的促进作用,而DLL1对MSCs的增殖无明显影响;CCN3的促增殖作用并没有随着MSCs向成骨细胞分化而减弱;随着细胞密度的增加,CCN3促增殖的作用明显增强;抑制Notch、MAPK信号通路会减弱CCN3促增殖的作用。结论:高浓度CCN3可显著促进MSCs的细胞增殖,这一作用与细胞密度密切相关的Notch信号通路有关,可能是通过MAPK信号通路实现的。