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脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是发生在脊髓椎管神经元剧烈地创伤性损伤导致暂时或永久性的知觉及运动功能缺损。成年哺乳动物中枢神经系统(Central nervous system,CNS)受损后其轴突生长受到抑制而影响其神经再生及功能的自我修复,而外周神经系统神经纤维受损后却能进行自我修复并恢复其功能。影响CNS损伤修复和再生的因素很多,一方面是因为神经纤维生长能力受限、胶质瘢痕的形成及神经营养因子缺乏等多种因素致使损伤轴突再生困难;另一方面是由于损伤的中枢微环境中髓磷脂相关抑制因子(Myelin associated inhibitors,MAIs)及其受体的大量存在,进而介导髓磷脂抑制信号的传递。因此,通过直接干预MAIs抑制信号的传递促进神经再生,可能作为针对脊髓损伤行之有效的治疗方法之一。作为MAIs的共同受体,Nogo受体(Nogo-66 receptor,Ng R)和成对免疫球蛋白样受体B(paired immunoglobulin-like receptor B,Pir B)能介导MAIs抑制信号的传递,因此,抑制Ng R和Pir B可能会促进神经轴突再生和保护神经元生长锥完整,进而发挥神经再生的促进效应。核酸疫苗作为一种新的免疫治疗策略近年来已被广泛应用于各种疾病的治疗研究,而人GM-CSF具有增强机体免疫应答和促进T细胞增殖的能力,是一种重要细胞因子佐剂,同时,GM-CSF还具有神经保护作用,可激活神经干、祖细胞且抑制胶质瘢痕的形成。为探讨GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗对损伤脊髓的免疫治疗作用,本研究采用基因工程方法分别克隆Ng R、Pir B和GM-CSF基因片段,构建pc DNA-GMCSF-Ng R-Pir B真核表达载体,然后与脂质体一起形成复合核酸疫苗。免疫大鼠后通过免疫学、行为学及组织学等方法探讨GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗对损伤脊髓的修复作用及运动功能的改善情况,为中枢神经轴突再生的免疫治疗提供理论依据和实践基础。主要研究内容:1.真核表达载体的构建与鉴定及体外表达检测PCR扩增共表达GM-CSF、Ng R及Pir B目的基因片段,分别亚克隆至pc DNA3.1(+)质粒中,构建重组真核表达载体pc DNA-GMCSF-Ng R-Pir B,并进行PCR、酶切及基因测序鉴定。重组质粒通过脂质体法体外转染CHO细胞并用免疫荧光法检测Ng R和Pir B蛋白的体外表达情况。2.制备GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗将脂质体与GMCSF-Ng R-Pir B重组质粒以1:1的体积比混合后形成核酸疫苗,以SD大鼠为研究对象,肌肉注射连续免疫6w,期间每周检测免疫血清中抗体的效价。同时观察动物体重及行为学改变情况,评价疫苗免疫能否引起大鼠变态性脑脊髓炎。3.双靶向GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗对损伤脊髓的免疫治疗作用核酸疫苗连续免疫6w后,制备脊髓左侧半横切损伤动物模型,并分别从行为学、组织学及分子水平评价GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗对轴突再生及运动功能改善的促进作用。主要结果及结论:1.成功构建了GMCSF、Ng R和Pir B共表达的真核表达载体。2.制备了双靶向GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗及SD大鼠左侧半横切脊髓损伤动物模型。3.双靶向GMCSF-Ng R-Pir B核酸疫苗能刺激机体免疫系统产生特异性抗体,中和内源性Ng R及Pir B,有效逆转中枢神经系统Ng R和Pir B介导的髓磷脂再生抑制信号的传递,促进受损脊髓神经纤维的修复及运动功能的改善。