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背景:肝癌是严重威胁人类健康的疾病之一,近几年来,肿瘤干细胞学说的提出,为肝癌的研究指出了新的方向。肿瘤干细胞理论认为:肿瘤干细胞就是肿瘤的种子细胞,是肿瘤发生、发展、维持的原始细胞,也是肿瘤复发转移的根本原因。目前治疗肝癌的方法主要是手术、放疗、介入、生物治疗等,但是治疗后复发率高,继发的药物耐药等现象的存在是肿瘤干细胞存在的结果,只有清除了这些细胞,才能根治肿瘤。然而,肝癌干细胞的研究尚处于初步阶段,怎样去得到大量的肝癌干细胞是目前研究的难点,因为无论是在外周血还是肝癌组织中肝癌干细胞的数量都是极其有限的,肝癌干细胞的分离对肝癌的研究有很重要的意义,之前,研究者一般是采用免疫荧光活化细胞分选法(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)或者是免疫磁珠分选法(Magnetic-activated cell sorting,MACS),以CD90、CD44等标志物分离和鉴定具有肿瘤干细胞的特性的肝癌干细胞,但是存在很多不足。2004年的香山会议上,曾益新首次提出:肿瘤干细胞不仅来源于成体细胞的恶性转化,还来源于普通肿瘤细胞在化疗的刺激下,基因组不稳定性被诱导而生成。随后,2007年,Yang等化疗富集乳腺癌干细胞成功;2008年Levina等对体外培养的人肺癌细胞进行化疗,成功的富集出肺癌干细胞。很多研究表明CD90是肝CSCs细胞公认的表面标记物,Yang等发现,在众多的与各种干细胞相关的表面标志物,表达CD90的细胞与肝脏潜在的致瘤能力是相关的,继续对这些细胞进行表面标记物的分析发现部分细胞还表达CD44,CD44是透明质酸的一种细胞表面受体,且在肝癌的侵袭及转移中起着重要作用。因此,本研究旨在建立一种体外有效富集、鉴定具有肝癌干细胞特性的细胞亚群的方法,为进一步研究肝癌治疗的新靶点提供新方法。目的:1.体外模拟体内化疗方案,探索化疗条件,获取化疗残存细胞。2.探索化疗前及化疗残存细胞形态学差别及CD90、CD44表达的差异性并分析其意义。方法:1.通过体外联合化疗富集获得化疗残存细胞,倒置显微镜下观察化疗前后细胞形态的变化。2.使用免疫细胞化学染色的方法检测化疗前后细胞表面标志物CD90、CD44的表达情况。3.使用流式细胞仪检测化疗前后细胞表面标志物CD90、CD44阳性细胞的百分率。结果:1.化疗前后肝癌细胞的形态学变化:化疗前:细胞在贴壁前在显微镜下观察到的是均一的单个的圆形细胞,24小时内贴壁,之后开始分裂增生,细胞呈汇合生长,排列紧密、轮廓清楚,连接成片,形态多样,有梭形、多角形、多边形;化疗后:化疗后细胞数量明显减少,细胞排列疏松,细胞皱缩成小球状。2.流式细胞仪检测结果:对照组标为①,稀释倍数100的标为②,稀释倍数50的标为③,稀释倍数30的标为④,稀释倍数25的标为⑤,稀释倍数20的标为⑥。(1)对照组和化疗残存组CD90~+百分数比较:CD90~+细胞在①组的平均阳性率为(0.74±0.1)%,②组的平均阳性率为(8.54±0.68)%,③组的平均阳性率为(14.96±0.55)%,④组的平均阳性率为(22.16±0.37)%,⑤组的平均阳性率为(21.1±0.21)%,⑥组的平均阳性率为(19.04±0.16)%。6组比较F值为4.240,P<0.01,差异有统计学意义。对照组①与各组比较P都小于0.01,差异有统计学意义。且随着稀释倍数的减少也就是随着药物浓度的增加CD90阳性表达增加,当浓度增加的一定程度时在增加浓度CD90阳性表达反而减少。(2)对照组和化疗残存组CD44~+百分数比较:CD44~+细胞在①组的平均阳性率为(0.25±0.08)%,②组的平均阳性率为(4.98±0.23)%,③组的平均阳性率为(9.06±0.25)%,④组的平均阳性率为(13.39±0.32)%,⑤组的平均阳性率为(13.10±0.33)%,⑥组的平均阳性率为(12.46±0.20)%。6组比较F值为4.50,P<0.01,差异有统计学意义。对照组①与各组比较P都小于0.01,差异有统计学意义。且随着稀释倍数的减少也就是随着药物浓度的增加CD44阳性表达增加,当浓度增加到一定程度时再增加浓度CD44阳性表达反而减少。3免疫细胞荧光染色结果:(1)对照组和化疗残存细胞在CD90~+阳性表达上的比较:对照组和化疗残存组各选择10张照片每张照片随机选择一个大约含有10个细胞的视野计数发现,空白对照组偶见胞浆和胞膜有绿色荧光颗粒,有荧光颗粒表达的细胞数为1%,化疗残存组有荧光颗粒表达的细胞广泛存在,荧光表达的细胞数为23%,差异有统计学意义(X~2=22.917,P<0.05)。(2)对照组和化疗残存细胞在CD44~+阳性表达上的比较:对照组和化疗残存组各选择10张照片每张照片随机选择一个大约含有10个细胞的视野计数发现,空白对照组偶见胞浆和胞膜有绿色荧光颗粒,有荧光颗粒表达的细胞数为2%,化疗残存组有荧光颗粒表达的细胞广泛存在,荧光表达的细胞数为14%,差异有统计学意义(X~2=9.783,P<0.05)。结论:1.HepG2肝癌细胞株经体外联合化疗后,化疗残存细胞CD90、CD44表达明显增加,提示化疗能够富集肝癌干细胞。2.随着化疗药物浓度的增加,表达CD90、CD44百分率增加,当增加到一定浓度时,继续增加浓度,表达CD90、CD44百分率反而减少,且浓度在血浆高峰浓度的1/30倍时表达的百分率最高。