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非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是近年来逐渐认识到的十分常见的慢性肝病,包括单纯性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver,NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)和NASH相关性肝纤维化及肝硬化。NASH具有脂肪变性、肝细胞损伤及炎症细胞浸润等病理改变,可发展演化为肝硬化、肝癌,一般预后较差。NASH的发病机制至今尚未明确,目前普遍接受的是以胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)、氧化应激和脂质过氧化为中心的“二次打击”学说。肝细胞内有丰富的内质网,是蛋白质合成、折叠、运输以及储存钙的主要场所。内质网对各种刺激极为敏感,当机体功能紊乱时出现错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集以及细胞内钙平衡紊乱的状态,称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。ERS主要激活三条信号通路:未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)、超负荷反应(endoplasmic reticulum overload response,EOR)和固醇调节级联反应。近年来对于ERS信号通路及其效应在代谢综合征(metabolic syndrome,MS)如肥胖、IR和2型糖尿病等中的研究十分广泛。因此,我们认为作为与MS密切相关的NASH,其发病机制可能与ERS信号通路存在重要的联系。既往研究发现脂肪酸在内质网代谢会产生一定量的活性氧(reactive oxygenspecies,ROS),而ROS又是ERS的重要诱发因素,因此我们推测当高脂饮食引起脂肪酸过载时,通过产生ROS和脂质过氧化物触发肝绌胞发生ERS,启动UPR和固醇调节级联反应信号途径,其中固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element bindingprotein,SREBP-1c)表达上调,可增加脂肪合成酶等的表达,造成脂肪酸合成异常增多,肝脏脂质代谢障碍;当出现过强或者持久刺激时,内质网功能紊乱得不到修正,造成UPR过载,激发氧化应激,引起脂肪变的肝细胞发生变性和坏死,从而导致NASH的发生。本研究旨在通过检测ERS时UPR和固醇调节级联反应中的标志性分子在高脂饮食诱导大鼠NASH形成中的表达变化,初步探讨ERS在NASH形成中的作用及意义。主要研究内容和结果如下:研究内容和方法:Wistar成年雄性大鼠30只,随机分为对照组(C组)与NASH组。其中NASH组分为4、8、12、16周4个时相点,各时相点随机分配6只动物。C组给予基础饲料,NASH组给予高脂饲料(基础饲料82.5%,猪油10%,胆固醇2%,蔗糖5%,胆盐0.5%)。动态观察各组:①HE染色光镜观察肝脏组织病理改变;②血清FFA、TG、ALT、AST含量的测定;③肝组织MDA、FFA、ROS含量的测定;④半定量RT-PCR检测ERS标志物GRP78、UPR标志物ATF6和固醇调节级联反应标志物SREBP-1c mRNA的表达变化;⑤相对定量PCR检测GRP78、ATF6 mRNA的表达变化;⑥Western blot法检测GRP78、ATF6、Phospho-PERK、SREBP-1c的蛋白表达变化。研究结果:1、HE染色观察肝组织病理学改变结果显示C组大鼠肝脏大体形态和病理切片均正常。高脂喂养4、8、12、16周后,肉眼可见大鼠肝脏色泽变黄,包膜紧张,边缘圆钝,切面黄色、油腻,组织松脆;随高脂喂养时间的延长,病理学可见肝细胞脂肪变及气球样变,小叶中央区炎症,腺泡3带出现点灶状坏死,并逐渐发展至门管区轻～中度炎症。按非酒精性脂肪性肝病诊疗指南划分为:NASH-F1G0期、F2G1期、F3G2期、F4G3期。2、血清FFA、TG、ALT、AST的含量变化高脂喂养4周后,G0组血清FFA、TG、AST含量逐渐升高,随着高脂喂养时间的延长,G1和G2组血清中FFA、TG、ALT、AST含量明显增高,在16周G3组时达到高峰,与C组相比相差非常显著(P＜0.01)。3、肝组织MDA、FFA、ROS的含量变化高脂喂养NASH各组大鼠肝组织MDA含量与C组相比显著升高(P＜0.01)。肝组织FFA、ROS含量由高脂喂养4周时开始逐步升高,16周上升最为明显(P＜0.01)。4、半定量RT-PCR检测GRP78、ATF6和SREBP-1c mRNA表达变化高脂喂养4周后,GRP78和SREBP-1c mRNA水平随肝细胞脂肪变和炎症程度的加重而升高,在G3组中达到高峰(P＜0.01)。ATF6 mRNA水平在G0组与C组相比无明显差异(P＞0.05),在G1、G2、G3组时与C组相比明显升高(P＜0.01)。5、相对定量PCR检测GRP78、ATF6 mRNA的表达变化将C组样本设为对照,得出NASH各组样本中目的基因GRP78和ATF6相对对照样本的含量比值。结果显示NASH各组GRP78和ATF6 mRNA的表达水平与C组相比升高(P＜0.05),与半定量RT-PCR结果趋势一致。6、Western blot法检测GRP78、ATF6、Phospho-PERK和SREBP-1c蛋白表达变化高脂喂养4周后,GRP78、ATF6和SREBP-1c蛋白表达开始增强,并随高脂喂养时间延长逐渐增高,在G3组时达到高峰(P＜0.01)。Phospho-PERK蛋白水平在喂养4周时与C组相比无显著差异(P＞0.05),在G3组时达高峰(P＜0.01)。结论:1、高脂饮食诱导FFA生成增加,在FFA氧化过程中产生大量ROS、MDA,导致脂质过氧化产物在肝脏内过度累积,引发内质网应激的因素增加;2、在大鼠NASH形成过程中,ERS标志物GRP78和UPR标志物ATF6、Phospho-PERK以及固醇调节级联反应标志物SREBP-1c表达水平有随着肝脏炎症程度不断加重而升高的趋势;3、高脂饮食引起ROS等应激因素增加,通过启动UPR联合SREBP-1c造成ERS过度,表现为GRP78、ATF6、Phospho-PERK以及SREBP-1c表达水平升高,一方面增强脂肪酸相关酶基因转录导致肝细胞脂肪变,另一方面通过UPR作用最终导致NASH形成。