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使用脱羰秋水仙碱(demecolcine)诱导卵母细胞去核能提高去核效率,降低去核操作复杂性,并由此获得了克隆动物。但是近几年市面上已经很难买到脱羰秋水仙碱,所以需要寻找新的药物替代。我们用其类似物秋水仙碱(colchicine)(一种微管结构破坏剂)诱导小鼠卵母细胞去核,研究乙醇和Sr Cl2两种激活处理方法对秋水仙碱诱导去核效率的影响,并摸索秋水仙碱诱导去核过程中最佳处理浓度和作用时间,筛选最佳去核方案。采用免疫荧光技术观察比较秋水仙碱作用于激活卵母细胞和未激活卵母细胞的微管结构不同之处。为了评价秋水仙碱处理对卵母细胞质量的影响,本研究利用酶联免疫、定量PCR和荧光染色法检测了卵母细胞胞质内MPF活性(与核重编程和细胞周期相关)、ROS浓度(与氧化应激相关)及Bcl-2(与细胞凋亡相关)表达量的变化。主要研究结果如下:(1)Sr Cl2激活组和乙醇激活组在配合0.6μg/m L秋水仙碱处理卵母细胞60min后获得最高去核率,两者之间差异显著(34.38%,25.36%)(P<0.05),乙醇激活组中部分未成功去核的卵母细胞胞质内含有核碎片。我们猜测Sr Cl2和乙醇对卵母细胞激活机制的不同是导致去核率差异显著的原因。(2)免疫荧光结果显示,完全去核卵母细胞呈现两种形态,一种是染色体随第二极体完全排出,一种是染色体全部存在于卵母细胞皮质层形成的突起内。而突起部分会随着秋水仙碱处理时间的延长发生回缩进胞质的现象,这可能是导致秋水仙碱去核率较低的原因。(3)秋水仙碱处理已激活卵母细胞后,胞质中微管结构彻底消失,而处理未激活卵母细胞后,微管结构发生紊乱,但不会消失,该结果表明激活卵母细胞会协助秋水仙碱破坏微管结构。(4)秋水仙碱处理卵母细胞能够在整体上显著提高MPF活性值(P<0.05),抑制cyclin B1的水解,说明秋水仙碱处理能提高卵母细胞核重编程能力。(5)秋水仙碱处理未激活卵母细胞会显著提高卵母细胞胞质内ROS浓度(P<0.05),且导致Bcl-2表达异常,而处理已激活卵母细胞会降低ROS浓度(P>0.05),且Bcl-2表达量较对照组显著降低(P<0.05)。说明秋水仙碱不会引起激活卵母细胞发生氧化应激反应,同时可能不会引起细胞发生凋亡。综上所述,0.6μg/m L秋水仙碱配合Sr Cl2激活卵母细胞能获得最佳诱导去核效果,不会引起卵母细胞发生氧化应激,因而保证卵母细胞胞质内m RNA、蛋白质、脂质等物质不受到氧化损伤,推测该方法获得的去核卵母细胞有利于提高哺乳动物克隆效率。