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丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一类丝氨酸苏氨酸激酶，广泛存在于细胞中参与细胞多项功能。近期研究表明，MAPK信号通路在卵母细胞减数分裂过程中发挥重要作用。本文以斑马鱼卵母细胞体外培养成熟系统为基础，利用WesternBlot方法在卵母细胞发生生发泡破裂（germinal vesicle break down，GVBD）前后测定活化的MAPK（p-MAPK）的表达情况，并使用MAPK上游激酶MEK（MAPKK）的拮抗剂PD98059和U0126抑制MAPK的激活，同时检测卵母细胞发生GVBD的情况，以此来推断MAPK对斑马鱼卵母细胞减数分裂重新启动的作用。
第一部分：建立斑马鱼卵母细胞体外培养成熟体系。在体外培养卵母细胞的过程中，分离卵母细胞的方法及诱导激素的选择是本实验的关键问题。本文对体外培养斑马鱼卵细胞的分离方法和诱导激素进行了对比和筛选。结果表明，在卵母细胞的分离过程中，机械分离法获得的卵细胞的完整率（87.0％）和18小时27℃培养后的存活率（88.2％）显著多于机械-消化酶综合分离法（33.2％、60.1％）f，（P<0.01）。但机械分离法平均分离每个卵细胞所用的时间（0.69min）显著多于机械-消化酶综合分离法（0.17min）（P<0.01）。而采用机械分离法和机械-消化酶综合分离法对所获卵细胞在18小时后的成熟度（83.9％、77.5％）无显著差异（P>0.05）。在培养液中分别添加17α，20β-双羟孕酮（17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one）和17β-雌二醇（17β-estradiol）两种雌激素，数据显示，在1000ng/ml17α，20β-双羟孕酮培养液中，斑马鱼卵母细胞成熟率达80％以上所需要的时间为6小时，明显少于1000ng/ml17β-雌二醇组（12h）和空白对照组（14h）。分别以0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的17α，20β-双羟孕酮培养液培养卵母细胞，8h时其成熟率分别为31.5％、100％、84.8％、70.8％。显著高于培养于相同浓度的17β-雌二醇培养液中的卵母细胞的GVBD％（41.7％、60.7％、34.6％、40.0％）。结果表明，17α，20β-双羟孕酮对斑马鱼卵母细胞的成熟促进作用比17β-雌二醇显著；且两种激素都在低浓度（10ng/ml）时有更好的成熟促进效果。
第二部分：建立了斑马鱼卵母细胞中磷酸化MAPK的检测方法。实验采用WesternBlot方法检测卵母细胞中的磷酸化MAPK，针对斑马鱼卵母细胞的特点对检测过程中的干扰因子及灵敏度进行了探讨。结果表明，采用纯手工尖镊分离法与机械吹打分离法对卵母细胞中磷酸化MAPK的表达有显著区别（P<0.05）。机械吹打可以造成MAPK的激活，从而干扰对正常条件下卵母细胞中存在的磷酸化MAPK的检测。此外，分离卵母细胞是所获得的另一种大量存在的细胞——卵巢内颗粒细胞也是干扰正常检测的一个因素。实验结果表明，在斑马鱼卵母细胞发生GVBD前后较短的时间内，磷酸化MAPK1（p44ERX1）表达量远大于磷酸化的MAPK2（p42ERK2）的量，而在颗粒细胞中，MAPK1（p44ERK1）和MAPK2（p42ERK2）同时有大量表达，其中磷酸化MAPK2（p42ERK2）在颗粒细胞和卵母细胞中的表达有明显差异（P<0.05）。此外，实验还对WesternBlot方法对检测斑马鱼卵母细胞中磷酸化MAPK的灵敏度作了测验。在150μl的裂解液稀释浓度下，10、20、30、40、50个卵母细胞中所能检测的p-MAPK表达量表明，至少在20个卵母细胞中可以清楚地检测出磷酸化MAPK在斑马鱼卵母细胞中的真实表达情况。
第三部分：检测了斑马鱼卵母细胞发生GVBD过程中磷酸化MAPK的表达情况。实验结果表明，不同于卵母细胞发生GVBD的趋势，MAPK的大量磷酸化发生在卵母细胞发生GVBD的相对缓慢期，且在MAPK被大量磷酸化后的2小时内，GVBD率迅速上升。在30μMMAPK上游激酶MEK拮抗剂U0126的抑制作用下，卵母细胞大量发生GVBD的时间延后了4～6小时，且最终的GVBD％也比空白对照组低20％。此外，根据实验结果，在卵母细胞完成GVBD3小时后，p-MAPK1（p44ERK1）的表达量开始下降，完成GVBD6小时后，p-MAPK2（p42ERK2）开始有少量表达，且与p-MAPK1（p44ERK1）都成缓慢增多趋势。