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松嫩盐单胞菌(Halomonas songnenensis)NEAU-ST10-39~T是从中国的黑龙江省松嫩盐碱地筛选得到的生长范围为0.2-15%(w/v)的NaCl(最适为4%,w/v)和pH 5-10(最适为pH 7)的一株中度嗜盐菌(Moderate halophile)。那么,它可能进化了复杂的耐盐碱基因及其调节机制,以保持其细胞内稳定的渗透压和离子平衡。因此,在该菌株中很可能存在丰富的Na~+(Li+)/H~+逆向转运蛋白在与耐盐碱方面起着重要作用,因此,以松嫩盐单胞菌(Halomonas songnenensis)NEAU-ST10-39~T作为细菌耐盐碱基因挖掘的研究对象,获得重要的或新的耐盐碱基因的几率更大。本论文从基因文库的构建方法入手,结合盐离子耐受特性功能互补的方法,借助大肠杆菌(Escherichia coli)Na~+/H~+逆向转运蛋白缺陷株KNabc(Δnha A,Δnha B,Δcha A),从松嫩盐单胞菌(H.songnenensis)NEAU-ST10-39~T中克隆获得一个编码多亚基单价阳离子/H~+逆向转运蛋白(multisubunit monovalent cation/proton antiporter)的mrp操纵子。耐盐碱实验表明,mrp操纵子能够赋予大肠杆菌KNabc对0.8 M NaCl,120 m M Li Cl和碱性pH的耐受性。序列分析及蛋白同源比对结果表明此mrp操纵子包含有六个完整的开放阅读框,为Group 2型mrp操纵子,我们沿用mrp这一名称,又因其来自松嫩盐单胞菌(H.songnenensis)NEAU-ST10-39~T而被定名为Hs_mrp2。Hs_mrp2操纵子全长6,709 bp,包含6个完整的开放式阅读框架(ORF1-6),并且ORF1-6拥有一个共同的启动子和终止子,每个阅读框上游都有各自的SD序列。蛋白同源性比对结果表明,Hs_mrp2的六个亚基A’~G与来自盐单胞菌(Halomonas zhanjiangensis)中推测的Group 2型Mrp的六个亚基的同源性最高(88.4%to 97.2%)。目前,已鉴定的Group 2型Mrp仅有两个,并且Hs_Mrp2的各亚基与这两个已经鉴定的Group 2型Mrp包括Sm_Pha1(来自Sinorhizobium meliloti)和Vc_Mrp(来自Vibrio cholerae)的Mrp A’~G亚基具有相对较低的同源性,分别为28.7%~50.9%和25.9%~41.8%。以上结果暗示,Hs_mrp2可能编码一个新型的Group 2型Mrp系统,是目前在中度嗜盐菌属中发现的首个Group 2型Mrp。随后,我们用Hs_mrp2与已经鉴定和部分未鉴定的Group 1型Mrp和Group 2型Mrp利用邻接算法构建系统发育树,构建结果表明Hs_mrp2与推测的Hz_mrp2形成一个独立分支而与所有已鉴定的Group 1型Mrp和Group 2型Mrp相距较远,初步证明Hs_mrp2可能编码一个新型的Group 2型Mrp系统。为了证明Hs_Mrp2系统具有Na~+/H~+逆向转运活性。我们利用荧光猝灭法测定大肠杆菌(E.coli)KNabc/p UC-mrp2的反转膜(KNabc/p UC18为负对照)单价阳离子/氢离子逆向转运蛋白活性,结果发现,相对于负对照,KNabc/p UC-mrp2制备的反转膜特别是在pH9.0~9.5均具有Na~+(Li+,K+)/H~+逆向转运蛋白活性。为了进一步分析NEAU-ST10-39~T中Hs_mrp2的耐盐碱能力,我们借助基因敲除质粒p K18mobsac B构建了带有Hs_mrp2同源臂的重组质粒p K18-mrp2-Nco I,利用同源重组技术敲除宿主菌NEAU-ST10-39~T中该Group 2型Mrp基因,通过对原宿主NEAU-ST10-39~T和敲除菌株进行生理生化分析的结果,以证明本实验中所发现的Group 2型Mrp的基因对中度嗜盐菌NEAU-ST10-39~T在耐盐碱方面确实起到一定的作用。基于以上结果,我们认为Hs_Mrp2为一个对宿主NEAU-ST10-39~T在盐碱性方面起主要作用的新型的Group 2型Mrp系统,并且对于中度嗜盐菌中的Group 2型Mrp系统的发现来说尚属首例。