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除了受到体内化学信号的调节,组织和细胞的生长发育也与环境及内部的机械应力密不可分。细胞连接、细胞骨架、核LINC复合物以及核骨架等构成了细胞感受和适应机械应力的复杂网络。其中,一些关键分子的力学性质对于构建和维持这种应力网络具有重要作用。本文建立起了基于原子力显微镜的单分子力谱技术,并用于研究talin自抑制复合物的力学性质。初步探索了LINC复合物中SUN/KASH相互作用。另外本文也对泛素化相关酶类的相互作用进行了测量。 1.Talin是一种胞内黏着斑蛋白,连接着整合素与微丝骨架。Talin的整合素结合位点位于其N端的F3结构域上,但同一位点也可与其C端一个结构域RS(1655-1822)相结合,从而封闭了整合素结合活性。虽然新近解析的Talin自抑制晶体结构提出了能解释自抑制解除过程的细胞膜“拉-推”模型,但talin F3与RS的结合强度仍不清楚,两个结构域在外力下的解离性质仍属未知。 本文用原子力显微镜在不同加载速率下拉开F2F3/RS复合物,所测得的解离力依加载速率的对数呈现两段线性区域,说明外力下,有两个主要能垒对该分子对的稳定性起作用。在生理条件下(力的加载速率较小),外层能垒是解离速率大小的决定性因素。恒力拉伸试验发现F2F3/RS复合物的键寿命在低力范围内(<10pN)随力的增加无明显减小,反而有一定增加。而在大于10pN的外力下,键寿命迅速减小。说明talin自抑制复合物能够耐受小的排斥力,为它的激活设定了负调节阈值,有助于talin活性的精细控制。进一步分析发现,talin F2F3与RS可能存在两种结合状态,相对较弱的结合态在小力下占据多数。力的增加会改变两种状态的比例关系,从而使生存几率具有双重指数衰减性质。 离子浓度和突变体研究都说明一些位于结合面上的带电关键氨基酸对F2F3与RS的相互作用很重要。它们不仅会降低二者的结合概率,也会使其在受力时的解离性质发生变化。 F2F3与磷脂膜的力谱实验以及膜的荧光实验都显示F2F3可与负电磷脂相互作用,但这种作用力与F2F3/RS解离力差距不大,因此负电磷脂对talin的激活或许还需要更多力学相互作用的帮助。同时F2F3对膜的结合也会使负电磷脂更加聚集,并加快了它们的运动。 2.SUN和KASH分别为细胞核外膜和内膜蛋白,二者在核周隙中结合,起着连接细胞骨架和核骨架的作用。由于SUN蛋白在核周隙中还存在一个长的coiled-coil区域,不同截断的蛋白具有显著不同的聚合性质。本文表达了多种不同截断位置的蛋白并尝试了不同的反应条件,但均没有观察到SUN/KASH相互作用。这可能与溶液条件、coiled-coil区域的序列和截断位置有关。 3.泛素化是一种在动植物中广泛存在的细胞翻译后修饰过程。新近研究发现泛素化酶E2中的一种Ube2g2可以形成二聚体,从而促使其在自身泛素结合位点上合成多聚泛素链,再在E3酶的作用下将泛素链转移到底物上,从而加快底物的泛素化效率。ube2g2的二聚化特性仍有待进一步研究。本部分实验表明Cys48位点的突变降低了二聚体的结合力。另外,M3和M4突变类型也会使解离力降低。M3与M4的交叉相互作用与野生型相当,但却无益于其催化功能的恢复。另外携带了泛素的ube2g2更容易聚合,说明泛素的存在有助于ube2g2的二聚化。 综上所述,原子力显微镜的单分子力谱为研究生物分子的相互作用提供了便利的实验方法。这些大分子间的力谱结果有助于我们深入认识机械力传导通路中重要蛋白的力学性质,为解释未知机理和发现新的特质提供了参考和依据。