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我国约有400多万因角膜病致盲的患者，角膜移植术是其有效的复明手段。虽然角膜移植是目前同种器官移植中成功率最高的一种组织移植术，但穿透性角膜移植的排斥反应发生率仍占10％～30％，对于高危组病人(High-riskkeratoplasty patients)如：受体眼表新生血管化、持续炎症、大植片移植、第二次移植等，排斥发生率可高达60％以上，与其他器官移植(如肾脏、心脏和肝脏)的排斥率接近。因此，对于角膜移植整体而言，免疫排斥反应是角膜移植失败的主要原。如何降低和预防角移术后排斥反应已成为目前临床亟待解决的问题，而寻找高效低毒的免疫抑制剂是解决此问题的研究热点之一。目前以环孢霉素A(CsA)为主的免疫抑制剂在临床已得到广泛应用。但是，CsA的毒副作用较为明显，比如：肾毒性、高血压、糖尿病、神经系统毒性以及免疫抑制剂常有的并发感染和诱生肿瘤等；同时其治疗作用有限，对已产生排斥反应者，CsA不能起到很好的逆转作用。所以，研究开发新型高效、低毒的免疫抑制剂，一直是各国学者关注的热点。FTY720是从冬虫夏草寄生蝉幼虫的培养液中提取的抗生素成分ISP-1，并进行化学修饰的具有显著免疫抑制作用的合成药物，FTY720在啮齿类动物的皮肤、心脏、肾、肝脏及胰岛的同种移植和犬科动物的肝、肾同种移植实验中都显示出良好的免疫抑制活性。它能够显著延长移植物和移植受者的存活时间，其作用呈剂量依赖性。但此药物应用于角膜移植方面的报道很少，且尚未见局部使用的报道。FTY720的作用机制独特，不同于传统的免疫抑制剂。其药理作用是能迅速、明显地降低外周血淋巴细胞(PBL)，特别是T细胞数量，使淋巴细胞“归巢”于外周淋巴结、肠系膜淋巴结和Payer’s结中，而且作用可逆。这样可以将淋巴细胞“隔绝”于次级淋巴组织，保护移植物免受淋巴细胞的浸润和攻击。但关于FTY720对角膜移植模型大鼠术后血淋巴细胞的长期影响目前报道很少。FTY720与常规免疫抑制剂CsA具有协同作用，对啮齿类和灵长类动物模型给予亚剂量的CsA和FTY720可显著延长移植物的存活时间，可明显减少因为CsA所引起的毒副作用。与CsA等免疫抑制剂不同，在使用FTY720期间机体没有出现机会感染，治疗剂量的FTY720未出现类似CsA的肝、肾、神经毒性和糖脂类代谢异常或过度免疫抑制现象。本实验通过建立大鼠穿透性角膜移植模型，观察全身使用FTY720对大鼠角膜移植排斥反应的影响，动态监测大鼠外周血淋巴细胞数量以及某时间点检测角膜植片的血管内皮生长因子(VEGF)和白介素—2受体(IL—2R)的表达，从而进一步探讨FTY720的作用机制，为今后抗角膜移植排斥反应的临床药物治疗提供新的选择以及实验依据。研究目的：1．药效学观察：建立大鼠同种异体穿透性角膜移植模型，观察腹腔注射不同剂量的FTY720对植片免疫排斥反应的影响；并与1％环孢霉素A(CsA)滴眼比较，评价其效果，为将来应用于临床提供有效的给药方案。2．机制探讨：(1)角膜移植模型大鼠腹腔注射不同剂量的FTY720后，检测其外周血淋巴细胞数量在不同时间点的变化。(2)在植片急性排斥期，检测空白对照组和使用不同剂量的FTY720组植片的血管内皮生长因子(VEGF)和白介素—2受体(IL—2R)的表达。这些结果可以帮助我们从角膜移植排斥反应经典免疫途径对FTY720的可能作用机制进行探讨。研究方法：1．以SPF级Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体，建立同种异体穿透性角膜移植模型，随机分组(A、B、C、D)共4组，A组：空白对照组，B组：1％CsA滴眼组，C组：FTY720腹腔注射(0.2mg／kg／d)组，D组：FTY720腹腔注射(0.6mg／kg／d)组，各组从术后第一天开始用药，用至第14天停药。用裂隙灯显微镜观察比较各组角膜植片在术后12天透明度、水肿度、新生血管度、移植排斥指数(RH)情况以及植片发生排斥时间。采用SPSS12.0 for window统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，记录植片的存活时间，绘制Kaplan-Meier曲线，用Long-rank test进行比较；术后12天各组临床参数的比较应用单项方差分析(One-way ANOVA)法，各组之间比较采用LSD方法，显著性标准为P≤0.05。2、以SPF级Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体，建立同种异体穿透性角膜移植模型，随机分组(A、B)共2组，A组：FTY720腹腔注射(0.2mg／kg／d)组，B组：FTY720腹腔注射(0.6mg／kg／d)组，用药时间为术后第1天至14天。各组在术前、术后用药期间及停药后多个时间点对大鼠剪尾采集外周血，用血细胞自动计数仪行淋巴细胞计数。采用SPSS12.0 for window统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，记录各时间点不同组别大鼠的外周血淋巴细胞数量，采用重复测量数据的方差分析比较，显著性标准为P≤0.05。3、以SPF级Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体，建立同种异体穿透性角膜移植模型，随机分组(A、B、C)共3组，A组：空白对照组，B组：FTY720腹腔注射(0.2mg／kg／d)，C组：FTY720腹腔注射(0.6mg／kg／d)组，于术后12天取角膜植片，制作石蜡切片，HE染色，光镜下观察各组角膜植片病理学改变，免疫组织化学染色(SABC法)检测VEGF及IL-2R在各组角膜组织的表达及分布情况。采用SPSS12．0 for windows统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，应用单向方差分析(One-way ANOVA)比较，显著性标准为P≤0.05。研究结果：1．各组植片平均存活时间为：空白对照组(11.123±1.959)d，1％CSA点眼组(16.125±2.532)d，0.2mg／kg腹腔注射FTY720组(35.000±26.490)d，0.6mg／kg腹腔注射FTY720组(46.750±33.148)d。各组生存时间差别有统计学意义(X~2=53.746，P=0.000)，组间两两比较差异均有统计学意义(均为P=0.000)。2．急性排斥期，0.2mg／kg和0.6mg／kg FTY720组的植片新生血管程度均比空白对照组减轻(分别为P=0.001，P=0.000)；总的抗排斥效果来看(RI)，它们均比环孢素A点眼组好(分别为P=0.002，P=0.000)。3．FTY720对角膜移植模型大鼠外周血淋巴细胞的影响；(1)腹腔注射FTY720后，外周血淋巴细胞迅速减少，用药后5小时可降至谷底，0.2mg／kg组降至术前的35.2％，0.6mg／kg组降为17.4％。(2)在用药期间两组的PBL数量均维持在较低水平。整个观察期间B组比A组PBL更低(F=43.536，P=0.000)。(3)停药后PBL数量回升，0.2mg／kg组在停药后2周时升至用药前水平(P=0.444)0.6mg／kg组在停药后4周时升至用药前水平(P=0.809)。4．急性排斥期角膜植片的病理及免疫组化检查：(1)HE染色：空白对照组植片显著增厚，大量单核细胞和淋巴细胞浸润，新生血管形成；全身用FTY720组植片厚度正常，无明显炎性细胞浸润，无新生血管形成。(2)免疫组化：不同剂量的FRY720组植片VEGF和IL-2R阳性细胞数量均较空白对照组减少(P＜0.05)。结论：1．FTY720全身用药可以有效防治角膜移植排斥反应，延长植片存活时间，且效果较1％环孢素A点眼更佳，FTY720抑制急性排斥反应效果随用量的增加而加强。2．FTY720毒副作用极少，治疗窗宽，可以安全较大剂量使用。3．0.2mg／kg和0.6mg／kg剂量的FTY720腹腔注射均可抑制角膜新生血管的形成。4．FTY720可减少急性期植片中VEGF和IL-2R蛋白的表达，而且可以迅速减少外周血淋巴细胞数量，阻止炎性细胞对移植物的浸润，这可能就是FTY720抗排斥的主要机制之一。