论文部分内容阅读
第一部分:β3GnT8及其相关基因,多聚乳糖胺在肝癌中的差异表达分析目的:分析在肝癌细胞和肝癌组织中,β3GnT8及其相关基因,多聚乳糖胺的差异性表达。方法:(1)qPCR检测人正常肝脏细胞株Lo2和QSG7701,人肝癌细胞株SMMC7721、SK-HEP-1 和 HepG2 中 β3GnT1～β3GnT8 基因,O-糖基化起始酶ppGalNAcT1 和 ppGalNAcT2,GlcNAcβ1,6 分支 N-糖链关键酶 GnTV 的 mRNA 表达水平;(2)western blot检测人肝癌细胞株SMMC7721、SK-HEP-1和HepG2中β3GnT8蛋白表达;(3)qPCR检测临床病人肝癌组织和癌旁组织样本中β3GnT2、β3GnT8、GnTV和c-jun的mRNA表达;(4)免疫组织化学检测人肝癌组织和癌旁组织中β3GnT8、GnTV和c-jun的蛋白表达以及多聚乳糖胺结构表达水平。结果:(1)肝癌细胞株β3GnT8的表达水平高于正常细胞;β3GnT2与β3GnT8的表达趋势未见关联性;c-jun、GnTV的表达与β3GnT8在肝癌细胞株中的表达趋势基本一致;(2)肝癌组织中β3GnT8表达水平高于癌旁组织,GnTV、c-Jun和多聚乳糖胺表达趋势与β3GnT8表达趋势一致。结论:肝癌细胞中β3GnT8及其相关基因的差异化表达,提示可以利用几株肝癌细胞进行β3GnT8的功能研究,肝癌中c-jun和β3GnT8表达的一致性可初步推测在肝癌中β3GnT8可能受到c-jun的转录调控。第二部分:β3GnT8表达对肝细胞癌恶性生物学表型及其糖基化的影响目的:通过改变β3GnT8表达研究该基因对肝癌恶性生物学表型的影响,并对其控制合成的多聚乳糖胺结构、CD147蛋白糖基化和肝癌细胞糖链结构进行分析。方法:(1)慢病毒构建SK-Hep-1和SMMC7721细胞β3GnT8过表达细胞株;(2)利用β3GnT8RNA干扰载体下调HeβG2、SK-Hep-1和SMMC7721中β3GnT8的表达;(3)免疫共沉淀(Co-IP)检测肝癌细胞中CD147和β3GnT8的蛋白质相互作用;(4)lectin blot及western blot检测肝癌细胞中β3GnT8过表达细胞及下调表达后多聚乳糖胺水平和CD147糖基化水平;(5)体外transwell实验检测β3GnT8表达改变后对肝癌细胞侵袭和迁移能力的影响,体内裸鼠成瘤实验验证β3GnT8表达促进肝癌细胞成瘤能力;(6)凝集素芯片分析β3GnT8过表达对肝癌细胞中特征性糖链表达的影响;(7)MALDI-TOF质谱分析β3GnT8表达对肝癌细胞中N-糖链结构的影响。结果:(1)过表达及干扰β3GnT8可分别提高和降低细胞多聚乳糖胺的表达、CD147糖基化水平;(2)过表达及干扰β3GnT8可分别提高和降低细胞侵袭迁移能力,β3GnT8的表达可促进肝癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力;(3)β3GnT8与糖蛋白CD147在蛋白水平有相互结合作用,β3GnT8的表达可以促进高糖型CD147的表达;(4)凝集素结果显示β3GnT8的表达可增加肝癌细胞中LEL所识别的多聚乳糖胺结构,同时唾液酸化、岩藻糖修饰和N-聚糖的结构也相应增多;(5)质谱结果显示β3GnT8的表达在促进肝癌细胞恶性发展的同时N-糖基化程度也加强,同时可以促进潜在N-聚糖分支结构多聚乳糖胺的延伸。结论:β3GnT8的表达可以促进肝癌细胞的侵袭、迁移和成瘤性等恶性生物学表型;且能够促进糖蛋白CD147上糖基化水平以及细胞中多聚乳糖胺的表达丰度,CD147蛋白N-聚糖多聚乳糖胺结构的合成可能是受到β3GnT8的催化;β3GnT8可能是通过调控多聚乳糖胺结构的合成以及CD147糖基化水平来实现对肝癌细胞恶性表型的影响。第三部分:c-Jun对β3GnT8的转录调控研究目的:借助染色质免疫共沉淀和基因共转染技术研究转录因子c-Jun对β3GnT8基因表达的转录调控作用。方法:(1)染色质免疫共沉淀检测HepG2和SK-HEP-1肝癌细胞株中c-jun与β3GnT8的相互作用;(2)构建过表达及干扰c-jun的HepG2和SK-HEP-1肝癌细胞株;(3)过表达及干扰c-jun表达后检测β3GnT8、多聚乳糖胺、CD147糖基化、细胞侵袭及迁移能力;(4)过表达β3GnT8肝癌细胞株共转染c-jun干扰载体后检测细胞侵袭迁移能力和CD147糖基化及多聚乳糖胺表达变化。结果:(1)染色质免疫共沉淀结果显示,SK-Hep-1和HepG2细胞中转录因子c-Jun结合到β3GnT8基因的promoter区;(2)过表达及干扰c-jun能够调控β3GnT8的表达、CD147糖基化和多聚乳糖胺表达水平;上调及干扰c-jun可分别提高和降低肝癌细胞侵袭迁移能力;(3)共转染实验表明过表达β3GnT8稳转细胞转染c-jun干扰载体后会降低自身的表达水平,同时也降低了多聚乳糖胺、CD147糖基化水平和细胞侵袭迁移能力也。结论:(1)转录因子c-Jun可调控肝癌细胞的侵袭迁移能力;(2)转录因子c-Jun可调控β3GnT8表达,结合β3GnT8在肝癌中作用及c-Jun对肝癌细胞的侵袭迁移能力调控作用,可推断c-Jun调控肝癌细胞侵袭迁移可通过调控β3GnT8基因的表达,进一步通过多聚乳糖胺及CD147糖基化途径进行。