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前言:阿尔兹海默病(Alzheimers Disease,AD)是一种神经退行性疾病,发病率较高,患者最终生活自理能力完全丧失,给家庭和社会增加了沉重的心理和经济负担,成为一个严重的社会问题。面对目前严峻的AD发病形势,针对AD的研究已成为当务之急。
由多因素引起的AD病患基底前脑胆碱能神经元溃变、丢失,导致大脑皮层和海马的乙酰胆碱能神经纤维减少,乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach)神经递质缺失,最终产生空间记忆能力减退和认知障碍等痴呆症状。Ach在胆碱乙酰转移酶(Choline acetyltransferase,ChAT)的催化下合成,被乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)水解,AChE和ChAT是中枢胆碱能代谢的一对特异性酶,两者的活性直接影响脑内神经递质Ach的含量。此外,ChAT同时也是胆碱能神经元的特殊标志,常用来研究胆碱能神经元含量。神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)可防止ChAT阳性神经元溃变,促进海马胆碱能纤维再生,改善模型动物学习记忆能力。NGF须通过与胆碱能神经元表面的高亲和力受体酪氨酸蛋白激酶A(Tyrosine protein kinaseA,TrkA)结合才能发挥其作用。
植物化学物莱菔硫烷(Sulforaphane,SFN)是广泛存在于西兰花和其他十字花科蔬菜中的一种异硫氰酸盐,具有抗氧化、抗炎、神经保护等多种生物学功能,SFN被证实具有抑制组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)作用。HDACs参与调控表观遗传,而研究发现TrkA基因的转录调控与表观遗传有关。△NP73与TrkA启动子区的反应元件结合,募集HDACs,使组蛋白去乙酰化,抑制TrkA的表达,阻抑NGF介导的细胞分化,而该作用可被HDACs的抑制剂所抑制。关于SFN能否通过改变TrkA的表达从而影响NGF功能的发挥,进而对脑内胆碱能系统起到保护作用,目前尚未见报道。本研究以D-半乳糖(D-galactose,D-gal)和铝联合给药制备AD小鼠为模型,通过检测Ach含量和ChAT、AchE活性以及基底前脑内侧隔核(Medial septal area,MS)处胆碱能神经元情况,探讨SFN对AD模型小鼠胆碱能神经系统损伤是否具有干预作用;并通过HDACs活性以及NGF、TrkA基因转录和蛋白表达的变化揭示其干预机制。
材料与方法:
一、动物分组、处理及样品采集按体重将健康成年昆明种小鼠随机分为3组,每组16只,雌雄各半。模型组与干预组小鼠饮用含铝水(铝浓度为0.4 g/100 ml),并隔日一次经皮下注射200mg/kg D-gal;干预组小鼠每日一次经口灌胃25mg/kg SFN,模型组小鼠灌胃等量蒸馏水;同时设立溶媒对照组。实验期间各组小鼠自由摄食、饮水,每周称量体重1次,连续处理90天。末次灌胃SFN后4h,每组10只小鼠(雌雄各半)处死取脑,分离左、右大脑皮质,分别用于生化指标及基因转录水平测定;另6只小鼠灌注固定后,冠状切取前卤前2mm至后1mm处脑组织块,固定,用于免疫组化的测定。
二、检测指标及方法(一)大脑皮质Ach含量及AChE、ChAT活性应用分光光度法参照试剂盒说明进行测定,考马斯亮蓝法测定蛋白含量。
(二)MS处胆碱能神经元的检测采用免疫组织化学法测定MS处ChAT阳性细胞率。
(三)MS处NGF、TrkA蛋白表达采用免疫组织化学法检测MS处NGF、TrkA的蛋白表达。
(四)大脑皮质NGF、TrkA mRNA水平以β-actin作为内参基因,采用Real-time PCR(SYBR Green I嵌合染料法)分析NGF、TrkA mRNA相对表达量。
(五)大脑皮质HDACs活性采用Elisa法检测大脑皮质HDACs活性。
三、数据处理和统计分析实验结果用(x)±s表示,用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析比较不同组各指标间的统计学差异,以Homogeneity of variance test检验方差齐性,组间两两比较用LSD法,检验水准α=0.05。
结果:
一、大脑皮质Ach含量及AChE、ChAT活性与对照组和干预组相比,AD模型组小鼠大脑皮质Ach含量降低,但差异均无统计学差异;AD模型组和SFN干预组小鼠大脑皮质AChE、ChAT活性均未见明显改变。
二、MS处胆碱能神经元丢失情况AD模型组小鼠MS区细胞突起减少,颜色变浅,细胞萎缩。模型组小鼠MS处ChAT阳性细胞率少于对照组和干预组,差异均具有统计学意义(P<0.01);干预组与对照组小鼠MS处ChAT阳性细胞率,差异无统计学意义(P>0.05)。
三、MS处NGF、TrkA蛋白表达AD模型组小鼠MS处NGF的积分光密度(Integtal optical density,IOD)值高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),干预组小鼠MS处NGF IOD值与对照组和模型组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);模型组小鼠MS处TrkA的IOD值低于对照组和干预组,差异均具有统计学意义(P<0.05),干预组小鼠MS处TrkA IOD值与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
四、大脑皮质NGF、TrkA mRNA水平各组小鼠大脑皮质NGF、TrkA mRNA水平均无统计学差异(P>0.05)。
五、大脑皮质HDACs活性AD模型组小鼠大脑皮质HDACs活性高于对照组,差异具有统计学意义(P>0.05),干预组小鼠大脑皮质HDACs活性与对照组和模型组相比,均未见统计学差异(P>0.05)。
结论:
1、SFN可减少AD模型小鼠基底前脑区MS处胆碱能神经元的丢失。
2、AD模型组和SFN干预组小鼠大脑皮质Ach含量及AChE、ChAT活性均未见明显改变。
3、SFN可抑制AD模型小鼠大脑皮质的HDACs异常升高。
4、SFN对AD模型小鼠MS处NGF和TrkA蛋白表达的变化具有明显的改善作用。
5、AD模型组和SFN干预组小鼠大脑皮质NGF、TrkA mRNA水平未见明显改变。