橄榄多酚氧化酶酶学性质及基因克隆表达研究

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多酚氧化酶(EC.1.14.18.1)广泛存在于动物、植物和微生物体内,是一种由核基因编码的含铜金属酶。它是果蔬储藏和加工过程中酶促褐变的重要酶类,能够催化酚类物质的氧化。  以橄榄(长营)为原料提取多酚氧化酶进行了分离纯化,得到比活力为1834U/mg的多酚氧化酶粗酶液。研究橄榄多酚氧化酶的理化性质,酶的pH和最适温度分别为6.0和30℃,酶在低于60℃和在pH4.0~8.0范围内较稳定;在30℃、pH6.0条件下,多酚氧化酶催化L-DOPA氧化反应的Km为3.884 mmol/L。  测定了几种修饰剂对橄榄多酚氧化酶的修饰作用,结果表明二硫键、精氨酸残基、赖氨酸残基和丝氨酸残基对多酚氧化酶具有修饰作用。  金属离子K+、Li+、Mg2+和Ba2+对多酚氧化酶活力没有影响,Zn2+、Al3+、Mn2+和Cu2+对酶有激活作用。  从苯甲醛半胱氨酸席夫碱及其衍生物中筛选多酚氧化酶抑制剂,探讨各种效应物抑制剂对橄榄多酚氧化酶活性的影响。研究发现苯甲醛半胱氨酸席夫碱及其衍生物的结构与它们抑制作用的强弱与抑制类型相关。选取4-羟基苯甲醛半胱氨酸席夫碱为代表化合物,研究了其在橄榄保鲜方面的作用,4-羟基苯甲醛半胱氨酸席夫碱类化合物对橄榄具有良好的防褐变作用和抗菌活性。  以橄榄为材料,提取RNA,应用反转录PCR的方法克隆得到橄榄PPO基因并进行原核表达。利用生物信息学的方法,对橄榄的多酚氧化酶基因及其蛋白进行分析。基因开放阅读框全长1821 bp,没有内含子,编码的PPO属于亲水性蛋白,没有跨膜结构,含有606个氨基酸,分子量约为68.4 Kd,理论等电点为8.14,是酪氨酸酶基因家族蛋白。另外,成功构建原核表达载体pET28a-PPO,并转化E.coli BL21。SDS-PAGE电泳显示,表达出一条约70 Kd的特异性蛋白条带,且蛋白分子量的大小与预期的基本一致。
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