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目的:纳米氧化锌(ZnONPs)作为一种常见的纳米材料,广泛应用于生物医药、食品等领域,其潜在的神经毒性越来越受到人们的重视。传统中药黄芪具有补气升阳、益气固表之功效。现代药理学研究证明黄芪及其活性成分具有强心、抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫调节及促进中枢神经系统再生与修复等药理作用。课题组前期研究发现,ZnONPs对SH-SY5Y神经细胞能诱导线粒体途径介导的凋亡从而表现出细胞毒性。本研究旨在探索黄芪活性成分对ZnONPs所致神经细胞毒性的保护作用,并在此基础上进行相应的机制研究,以期为黄芪在神经保护等领域的科学研究奠定基础。方法:1.选择人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y为实验对象,通过CCK 8法、LDH法检测黄芪及黄芪多糖、黄芪甲苷(ASIV)、毛蕊异黄酮等活性成分作用前后,ZnONPs(50 nm)对SH-SY5Y细胞存活率的影响。2.利用Annexin V-FITC/PI双染法检测ASIV在低、中、高三个剂量浓度对ZnONPs所致神经细胞凋亡的影响。Western blot观察凋亡相关蛋白caspase 3,caspase9,Bcl-2,Bax的表达水平。3.免疫荧光法观察ASIV作用前后,ZnONPs对细胞中自噬标志蛋白LC3表达的影响。Western blot检测p62、LC3Ⅱ、Beclin1等自噬相关蛋白的表达水平。同时,检测自噬抑制剂3-MA,自噬诱导剂RAPA的干预对细胞活力的影响。4.免疫荧光法观察ASIV作用前后,ZnONPs对细胞线粒体自噬体、线粒体自噬溶酶体、PINK1蛋白表达的影响。Western blot检测PINK1蛋白,胞浆和线粒体Parkin蛋白的变化,并通过NAO荧光法检测线粒体质量变化、流式细胞术检测细胞内活性氧含量变化、JC-1检测细胞内线粒体膜电位变化及胞内钙离子水平。结果:1.ZnONPs可明显抑制SH-SY5Y细胞活力,黄芪对ZnONPs造成的细胞毒性具有一定的保护作用。通过活性筛选发现在三种活性成分中,ASIV表现出神经细胞保护活性,而黄芪多糖和毛蕊异黄酮则没有显示保护作用。2.流式细胞术结果表明,ASIV分别作用12 h与24 h后,均能增加ZnONPs引起的SH-SY5Y细胞凋亡率;ASIV与ZnONPs共同作用24 h后,细胞内caspase 3、caspase 9和Bcl-2蛋白水平降低,Bax的表达水平升高,且呈剂量依赖性和时间依赖性。3.ASIV与ZnONPs共同作用24 h后,细胞内p62蛋白显著下调,LC3Ⅱ和Beclin1的表达上调;免疫荧光显示ASIV作用后荧光标记的LC3Ⅱ蛋白表达升高,荧光强度增强;3-MA的干预能够减弱ASIV的神经细胞保护作用,RAPA干预能够增强ASIV的神经细胞保护作用。4.免疫荧光结果显示ASIV与ZnONPs共同处理后,细胞内PINK1蛋白荧光强度以及数量增加,LC3Ⅱ蛋白可与Mito-Tracker Green标记的线粒体共定位,线粒体可与Lyso-Tracker Red标记的溶酶体共定位;ASIV的干预可使细胞内PINK1蛋白表达升高、胞浆内Parkin表达下调、线粒体内Parkin表达上调,表明PINK1/Parkin介导的线粒体自噬的增强。此外,ASIV能够逆转ZnONPs导致的细胞内线粒体质量下降,ROS水平升高,MMP的升高,钙离子稳态失衡。结论:1.黄芪中的活性成分ASIV能够拮抗ZnONPs所诱导的神经细胞SH-SY5Y的细胞毒性;2.ASIV能够增加ZnONPs诱导的神经细胞凋亡;3.ASIV作用后,诱导细胞自噬以及PINK1/parkin介导的线粒体自噬,减弱ZnONPs对细胞和线粒体的损伤。4.ASIV通过激活自噬/线粒体自噬的生物学途径,发挥对ZnONPs所致的神经细胞毒性的保护作用。