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家蚕是重要的经济昆虫,其生产的茧丝是中国、印度等发展中国家农业收入的一个重要来源。家蚕又是一个模式昆虫,其遗传变异表型丰富,家蚕是鳞翅目昆虫的典型代表,同时也是理想的生物学模型,推动了动物科学和昆虫学的快速发展。作为家蚕体内的一种重要结构,脂肪体即是糖代谢、脂代谢和蛋白质代谢的中心,又是主要激素作用的靶组织,还具有解毒、贮存、排泄等生理功能。 Hedgehog(Hh)信号通路调节脊椎动物和无脊椎动物的生长发育,是一个保守的信号通路。Hh信号传导通路同时影响脂肪细胞分化,但其在不同物种间的调控机制还有待研究。弄清楚Hh信号通路在家蚕脂肪形成中的作用,可以帮助人们提高蚕卵和蚕丝的质量,对人类对抗脂肪代谢病也有重要意义。因此本文主要对BmSmo介导的Hh信号通路和家蚕脂肪生成之间的联系进行研究。 本文所涉及的研究主要包括以下五个方面: 1.对家蚕Hh信号通路的BmSmo基因进行了克隆和鉴定。对BmSmo基因序列进行生物信息学分析发现,家蚕Smo蛋白与其它物种(如果蝇、斑马鱼、小鼠和人等)的Smo蛋白的氨基酸序列均高度相似,证明了Smo蛋白是一种比较保守的蛋白质。 2.在BmN细胞系中进行了BmSmo基因的过表达实验,利用实时荧光定量PCR技术检测了BmSmo基因及其上下游基因以及脂肪标记基因AP2的转录表达水平,从而对BmSmo和AP2在Hh信号通路中的作用进行评估。结果表明:在Hh信号通路中,Ptc和Cos2为负调控因子,Smo、Ci、Fu为正调控因子。过表达BmSmo引起AP2的表达量降低,表明激活Hh信号通路抑制脂肪细胞分化。 3.为了进一步研究BmSmo基因的上下游基因BmPtc、BmFu和BmCos2在Hh信号通路中的调控作用,在BmN细胞系中进行了BmSmo、BmRtc、BmFu和BmCos2的RNA干扰实验。通过RNA干扰实验进一步表明:在Hh信号通路中,Smo、Ci、Fu为正调控因子,Ptc和Cos2为负调控因子,激活Hh信号通路抑制AP2基因的表达,抑制Hh信号通路促进AP2基因的表达。 4.药物处理-细胞实验。通过purmorphamine和cyclopamine两种药物处理家蚕BmN细胞。purmorphamine处理后,BmSmo基因的表达量明显上升,AP2基因的表达量明显下降。cyclopamine处理后,BmSmo基因的表达量明显下降,AP2基因的表达量明显上升。结果表明, purmorphamine促进BmSmo基因的表达而激活Hh信号通路从而抑制AP2基因的表达。而cyclopamine则抑制BmSmo基因的表达而抑制Hh信号通路,从而促进AP2基因的表达。 5.药物处理-个体实验。为了检测Hh信号通路对家蚕幼虫中脂肪生成的调控作用,对健康状况良好的五龄家蚕分别注射purmorphamine和cyclopamine。结果表明,purmorphamine激活Hh信号通路,有抑制家蚕脂肪细胞分化的趋势;cyclopamine抑制Hh信号通路,有促进家蚕脂肪细胞分化的趋势。 本研究结果表明:激活Hh信号通路抑制家蚕脂肪细胞分化,抑制Hh信号通路促进家蚕脂肪细胞分化。