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研究背景与目的:未分化甲状腺癌（Anaplastic Thyroid Cancer,ATC）是甲状腺癌中一种少见类型,侵袭能力极强,中位生存期仅为6个月,1年生存期为20%。由于约70%患者诊断时已伴远处转移,因此化疗是首选。但是,未分化甲状腺癌的失分化状态使其对化疗不敏感。目前多西他赛联合阿霉素是治疗ATC的一线化疗药物,两者不但引起严重的不良反应,还往往容易诱发耐药,导致治疗失败。白藜芦醇是一种天然多酚类化合物,具有诱导分化,抑制肿瘤细胞增殖和去甲基化等作用。这些点在ATC体外实验体系也得到证明,但其体内治疗ATC的效果及其对获得性化疗耐药ATC细胞的疗效尚无研究报道。为此,本研究进行了以下研究:（1）验证白藜芦醇对ATC的诱导分化作用;（2）建立THJ-16T ATC细胞系裸鼠皮下肿瘤模型,腹腔注射白藜芦醇和多西他赛/阿霉素,观察药物体内疗效;（3）当移植瘤出现多西他赛/阿霉素耐药时,对其进行体外2D和3D培养及对白藜芦醇敏感性分析;（4）由于IL-13Rα2高表达于甲状腺癌组织,而低表达于癌旁正常组织,被认为是甲状腺癌的靶点蛋白。而Pep-1是构成IL-13蛋白的9个氨基酸（CGEMGWVRC）短肽链,具有特异性结合IL-13Rα2能力。针对白藜芦醇全身给药生物利用度低的问题,制备并验证Pep-1-PEG3.5k-PCL4k@Res靶向纳米颗粒体内抗ATC效果;（5）利用下一代测序（Next generation sequencing,NGS）测序比较原始和耐药THJ-16T细胞基因组差异,揭示导致继发耐药的遗传学背景。材料与方法:本课题选用ATC THJ-16T、THJ-21T及正常甲状腺Nthy-ori 3-1细胞系作为研究对象,MTT和Ed U分析白藜芦醇对细胞系增殖影响;TUNEL染色分析对细胞凋亡的影响;通过RT-PCR、Western Blotting分析分化指标钠碘转运体（Sodium/iodide symporter,NIS）、PTEN及E-钙黏蛋白（E-cadherin）基因及蛋白表达变化,并进一步利用ICC和IF分析其在细胞内分布改变。同时,建立ATC THJ-16T皮下移植瘤裸鼠模型,然后分别给予白藜芦醇、Pep-1-PEG3.5k-PCL4k@Res纳米靶向颗粒、多西他赛联合阿霉素治疗,TUNEL染色检测对照组和纳米靶向颗粒治疗组肿瘤组织细胞凋亡情况。并进一步分离化疗组移植瘤肿瘤细胞行2D和3D培养（命名:THJ-16T/R）,通过活死细胞计数、TUNEL、Ed U、HE染色分析与原始THJ-16T细胞系之间多西他赛/阿霉素及白藜芦醇敏感性差异。最后,利用NGS测序比较原始和耐药THJ-16T细胞基因组差异,DAVID数据库对耐药细胞系特异突变基因位点进行功能富集和信号通路分析,进一步根据ACMG遗传变异分类标准与指南以及文献查阅筛选出与耐药相关的基因突变位点并对突变致病性进行预测。结果:1.100μM白藜芦醇处理ATC THJ-16T和THJ-21T细胞系后,与对照组（0.1%DMSO处理组）相比,细胞形态明显改变,细胞增殖受到抑制（59.16%vs 2.98%,THJ-16T,p<0.01;47.35%vs 4.74%,THJ-21T,p<0.01）,并且诱导了ATC细胞凋亡（1.52%vs 62.86%,THJ-16T,p<0.01;1.62%vs 39.58%,THJ-21T,p<0.01）;而其对正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1增殖（p>0.05）和形态无明显影响;2.白藜芦醇抑制的ATC细胞系中PTEN蛋白过表达并且与NIS蛋白共同出现核易位,且E-cadherin蛋白出现明显膜表达;3.体内实验结果表明,相较于对照组和游离白藜芦醇组,化疗组和Pep-1-PEG3.5k-PCL4k@Res纳米靶向颗粒组能够明显延缓肿瘤生长（p<0.01）,且HE和TUNEL染色结果显示靶向纳米颗粒能够明显诱导肿瘤细胞凋亡;4.化疗组中2/3的荷瘤裸鼠在治疗期间体重下降超过10%,导致被迫停药,但停药1周后化疗组裸鼠皮下肿瘤复长;5.药物处理后,活死细胞比结果显示:THJ-16T/R化疗组死细胞比例明显低于THJ-16T中相应处理组;且THJ-16T/R化疗组中细胞增殖比例明显高于THJ-16T组;白藜芦醇处理后诱导了THJ-16T/R细胞凋亡,但化疗却没有;6.NGS测序发现THJ-16T细胞系中总共307个突变基因,共计887个突变位点,而THJ-16T/R细胞系中检出302个突变基因,计852个突变位点;7.THJ-16T/R细胞系特异突变位点40个,GO功能富集主要在细胞增殖、凋亡、药物响应,而KEGG分析主要为药物代谢和癌症相关信号通路;8.差异的耐药相关的基因突变位点致病性预测结果显示:THJ-16T KMT2D-c.8785C>A为良性突变,ABCB1-c.2871C>G是致病性突变。而THJ-16T/R中4个突变（MKRN1-BRAF融合（M3:B10）;KMT2D-c.8339C>T;PDGFRB-c.1042G>T;CDH1-c.2359G>A）均为致病性突变。结论:1、在白藜芦醇增殖抑制的ATC细胞中,PTEN表达上调（机制可能是白藜芦醇去甲基化引起）并与NIS蛋白共同出现核易位;2、PTEN与NIS共同核易位的现象预示ATC更好的治疗效果,可作为ATC预后指标;3、白藜芦醇缓释靶向纳米颗粒而不是游离的白藜芦醇能有效抑制ATC的体内生长;4、多西他赛/阿霉素能有效抑制裸鼠ATC皮下肿瘤增长,但会引起明显的副作用和获得性耐药;5、白藜芦醇能够逆转获得性化疗耐药,有望成为化疗敏感和耐药ATC的新型治疗方法;6.THJ-16T/R耐药可能机制与以下几个基因突变位点相关:MKRN1-BRAF融合（M3:B10）,KMT2D-c.8339C>T,PDGFRB-c.1042G>T,CDH1-c.2359G>A;而ABCB1-c.2871C>G突变是THJ-16T细胞系化疗药物敏感性突变。再结合各位点的突变丰度,我们认为MKRN1-BRAF（M3:B10）融合突变和KMT2D-c.8339C>T是THJ-16T/R化疗耐药的主要机制。