论文部分内容阅读
MII期的成熟卵母细胞经过正常受精而被激活，并进入胚胎及其后的发育过程，此外成熟的卵母细胞也可以通过人为施加物理或者化学的人工刺激而被激活，从而能够完成第二次的减数分裂，进入后续发育进程，这种并不通过精子的受精而使得卵母细胞激活的方式就是孤雌激活。在体细胞核移植中，核移植胚胎构建完成后，重构胚的激活就是克隆能否成功的关键，它影响着核移植的成败。用现有的孤雌激活方法得到的重构胚激活效率以及发育效率均与正常的精子激活卵母细胞的效率相比还有很大差距。所以，在核移植研究中如果采用能够模拟精子激活卵母细胞的类似机制，也许能够有效的提高核移植的整体效率。在受精过程的研究中，研究人员发现了精子中存在一种特殊的因子，随着精子和卵母细胞发生膜融合进入卵母细胞胞质中，使得卵母细胞中产生规律的Ca2+波动，从而激活卵母细胞。研究人员将这种特殊的精子因子称为精子卵母细胞激活因子（SpermOocyte Activation Factor，SOAF）。现已证实这种因子就是存在于精子头部的磷脂酶PLCζ。将PLCζ注入小鼠的卵母细胞，能够诱发与受精时相似的Ca2+波动，并且胚胎能够继续发育至囊胚期。利用抗体消耗精子提取物中的PLCζ，能够抑制卵母细胞内Ca2+产生。精子组分研究表明PLCζ与精子引发Ca2+波动的能力高度相关。关于PLCζ的序列比对分析表明，PLCζ缺乏其他PLC亚型都具有的N-端普列克底物蛋白同源结构域。但是PLCζ在N-端还有一个串联的EF手结构域，与XY结构域相邻，这个结构域在所有PLC亚型中都能被发现，是PLCζ有催化活性的部位。本试验以牛的卵母细胞为材料，对牛PLCζ全长分子及其不同结构域在牛卵母细胞激活中所起的作用进行了探讨。1.成功克隆牛全长型的PLCζ以及PLCζ-XY基因并构建了真核表达载体pVenus-PLCζ以及pVenus-XY，转染Hela细胞均能够正常表达。2.将牛pVenus-PLCζ/pVenus-XY进行体外转录，将得到的cRNA通过显微注射的方法注射入培养了25-26小时的牛卵母细胞内，并将注射过cRNA的牛卵母细胞放入G1中培养，观察3天，并未发现成功卵裂的卵母细胞。根据以上结果我们构建的牛PLCζ未能有效激活被阻滞在第二次减数分裂中期的牛卵母细胞，也不能使之进行卵裂。这一结果跟文献中其他物种，如人或者小鼠的PLCζ激活情况不一致。这可能是因为我们所得到的牛PLCζ的cRNA并不能在卵母细胞中发挥作用，同时我们现有的试验条件并不能使我们监测到牛PLCζcRNA在进入卵母细胞之后能否引发牛卵母细胞Ca2+波动。因此，我们认为我们所得到的牛PLCζ的cRNA并不能使牛卵母细胞越过第二次减数分裂的阻滞进入胚胎发育阶段。