研究背景:造血干细胞(Hematopoietic stem cell,HSC)是一种具有自我更新和多向分化潜能的干细胞,目前HSC移植用来治疗各种疾病包括白血病、淋巴瘤、免疫系统疾病、多发性骨髓瘤以及骨髓衰竭综合征。目前全球同种异体和自体HSC移植得到广泛临床应用,但是仍然面临着诸多问题,如供着来源的HSC数量,获得人的白细胞抗原匹配的供者以及移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)。多能干细胞(Pluripotent Stem Cell,PSC)包括胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell,ESC)和诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell,iPSC),具有体外自我更新和多向分化潜能,因此可以源源不断的提供移植所需要的HSC,另外从病人身上通过体细胞重编程技术获得的PSC,体外诱导分化产生HSC,可作为疾病模型探究疾病的病因,同时提供一个以细胞为基础药物筛选平台。尽管在过去数十年,研究者们不断在探究PSC诱导分化产生可移植的HSC,但并没有建立一种高效获得PSC来源的可供移植的HSC。目前PSC向HSC分化方法主要有(1)利用小鼠或人的基质细胞来诱导PSC造血分化;(2)利用拟胚体(Embryonic bodies,EBs)方法来诱导PSC造血分化;(3)两种方法相结合;(4)畸胎瘤方法。同时采用细胞因子和转录因子结合上述方法,但是PSC向HSC分化依然存在关键科学问题需待解决:(1)诱导分化效率不高;(2)诱导分化获得的HSC体内很难实现长期造血植入潜能。前期的PSC造血分化研究集中于二维环境中进行,其实三维环境较二维环境能更接近的模拟自然状态下三维组织结构,在体内胚胎造血发育过程中,细胞与细胞之间不仅相互接触,还需要与周围的细胞外基质环境所包含的各种黏附分子、胶原蛋白等组分相互接触共同来完成胚胎造血发育的过程。细胞外基质环境对细胞的增殖、分化、维持以及组织形态构成起着重要作用。现在研究者们日益致力于开发新型具有型模拟体内三维组织结构和细胞外基质生物学功能的生物材料来调控干细胞的生物学功能。体内胚胎造血发育过程中,造血微环境如主动脉-性腺-中肾区(aorta-gonads-mesonephros,AGM)、胎肝和骨髓中的基质细胞有利于促进体外PSC向HSC分化并维持和扩增PSC来源的HSC。研究报道AGM区来源的基质细胞AGM-S3促进人和小鼠的HSC扩增[34]。同时AGM-S3联合各种细胞因子促进人PSC向造血干细胞及下游谱系成体有核红细胞分化[35,36]。小鼠胎肝部位来源的基质细胞AFT024能体外高效维持小鼠造血干细胞的长期造血潜能[37]。人的胚胎干细胞与S17、骨髓来源的基质细胞OP9以及胎肝来源的基质细胞共培养自然诱导其向造血细胞分化,但是体外诱导分化效率低,获得的HSC体内没有或非常低的造血植入潜能[38]。本研究拟利用三维生物材料结合外源性促进PSC向HSC分化和扩增HSC的细胞生长因子,建立一种三维诱导小鼠PSC向HSC分化的体系,并结合HSC造血微环境中的基质细胞来优化建立的三维诱导分化体系,目的为了获得小鼠PSC来源的长期造血的HSC,同时我们比较3D培养系统和2D培养环境下对小鼠造血干祖细胞的扩增效果,为体外探究PSC向HSC分化的分子调控机制提供研究平台,为促进PSC来源的HSC向临床应用转化奠定理论基础。1第一章利用自组装多肽生物材料建立小鼠多能干细胞向造血细胞分化的诱导体系目的:体外诱导PSC产生HSC能作为替代骨髓移植的有效手段,并且不会引起GVHD。目前,多种方法被用于评估PSC向HSC的分化,但是诱导分化效率低以及获得HSC功能不完整限制了造血分化的进一步研究。我们研究目的为了建立一种更好模拟体内胚胎发育的3D造血诱导分化环境,促进PSC产生功能性的HSC,而这种3D诱导的条件的复杂性很难通过2D培养系统来实现。方法:首先用扫描电镜技术观察3D自组装多肽水凝胶的结构特征;其次探究3D自组装多肽水凝胶联合造血相关细胞因子诱导小鼠PSC向造血细胞分化,流式检测ckit、CD41、CD45表面分子蛋白的表达水平,荧光定量PCR检测多能性基因Oct3/4、内皮细胞相关基因CDH5、造血相关基因Gata1和HOXA9,造血表面分子CD41和CD45的表达;免疫荧光检测CD41和CD45表面分子蛋白水平表达;克隆形成实验(Colony Formation Unit,CFU)验证3D诱导系统分化获得的造血细胞体外向造血各谱系分化的潜能;6-8周NOD-SCID小鼠用来评估3D诱导系统来源的造血细胞的体内植入潜能。结果:利用3D自组装多肽水凝胶联合细胞因子能有效诱导小鼠PSC向造血细胞分化,流式检测结果显示ckit、CD41、CD45表面分子明显表达;荧光定量PCR检测表明多能性基因Oct3/4表达下调、内皮细胞相关基因CDH5、造血相关基因Gata1和HOXA9,造血表面分子CD41和CD45的基因表达上调;免疫荧光检测CD41、CD45表面分子得到表达;CFU克隆形成实验表明,3D造血诱导系统来源的造血细胞具有向各造血谱系克隆分化潜能;另外体内动物移植实验显示,移植三周后,外周血检测,CD45.2+细胞在NOD-SCID(CD45.1)小鼠体内植入率有3%,3D造血诱导系统分化获得具有短期造血植入潜能的多潜能造血祖细胞。结论:利用3D自组装多肽水凝胶联合细胞因子能有效诱导小鼠PSC向造血细胞分化,获得体外向各谱系造血分化潜能的造血细胞,体内具有短期造血植入潜能的造血祖细胞。2第二章利用OP9基质细胞提高自组装多肽生物材料介导的3D诱导分化体系的效率目的:OP9或OP9-DL1基质细胞体外有利于促进PSC向HSC分化,同时可促进体外胚胎发育过程中造血前体细胞和生血内皮细胞向HSC成熟分化,在第一章建立3D诱导小鼠PSC向HSC分化中,每个PSC向HSC分化不是同步的,3D系统中存在多种造血前体和发育早期造血细胞,我们接下来研究目的是利用造血微环境基质细胞OP9来进一步优化3D造血诱导分化系统,目的为了增强PSC向造血干祖细胞分化效率,获得更多功能性的HSC,为PSC向HSC分化的机制研究奠定工作基础。方法:OP9基质细胞联合细胞因子进一步诱导3D诱导系统分化来的造血样克隆,流式检测不同时间段中胚层表面分子、生血内皮细胞、造血干祖细胞的表面分子flk1、ckit、TIE2、CD144、CD41、CD45、Sca-1 以及目前最新文献报道的 CD201表面分子的表达;CFU克隆形成实验验证OP9基质细胞优化3D诱导系统分化获得的造血细胞向造血各谱系分化的潜能;结果:OP9基质细胞能有效促进3D诱导系统分化来的造血样克隆向造血前体及造血干祖细胞进一步成熟分化,流式检测结果显示ckit、TIE2、CD144、CD41、CD45、Sca-1、CD201表面分子明显表达;中胚层表面分子标记flk1表达水平在共培养诱导分化第2天到第5天上调,第5天到第8天明显下调;CFU克隆形成实验表明,OP9基质细胞优化3D造血诱导系统来源的造血细胞具有向各造血谱系克隆分化潜能;结论:利用OP9基质细胞能有效促进3D诱导系统分化来的造血样克隆向造血前体及造血干祖细胞进一步成熟分化,产生一群类似于胚胎发育过程中AGM区的pre-HSC,并且获得一群未见报道的CD201+LSK造血细胞。3第三章自组装多肽生物材料介导的3D培养体系较2D培养体系利于小鼠造血干祖细胞的扩增目的:为了探究自组装多肽生物材料介导的3D诱导系统确实有助于为体外探究PSC向HSC提供好的平台,我们进一步比较所建立的3D诱导系统较2D诱导系统是否有效对小鼠骨髓来源的造血干祖细胞进行扩增,为探究3D系统之所以利于PSC向HSC诱导分化的机理研究奠定基础。方法:分选小鼠骨髓来源的ckit+细胞,利用3D自组装多肽生物材料水凝胶联合造血相关细胞因子及小分子化合物对其扩增,并与2D同样扩增条件下作以比较扩增效果,普通光镜下观察ckit+细胞生长情况,流式检测两种不同条件下Lineage-Sca-1+ckit+(LSK)细胞比例,以及向下游各造血谱系细胞分化的程度。CFU克隆形成实验比较两种不同扩增条件克隆形成能力差别。结果:3D自组装多肽水凝胶联合细胞因子及小分子化合物,较2D同样条件下扩增ckit+细胞,能更好维持造血干祖细胞,3D环境中LSK(Lineage-Sca-1+ckit+)阳性细胞比例较2D条件下高,有明显差异;CFU克隆形成实验表明,3D与2D比较,同样细胞数量条件下,3D的CFU克隆数比2D的CFU克隆数高,有明显差异。结论:自组装多肽生物材料介导的3D培养体系较2D培养体系更有利于维持小鼠骨髓来源的造血干祖细胞干性,并且利于HSC下游血液各谱系细胞的生长维持,与2D比较,3D系统能更好模拟体内,营造维持HSC干性微环境,为探究PSC向HSC分化提供理论依据。