第一部分:供体肝细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究研究背景:免疫排斥是阻碍器官移植发展的重要因素。尽管相对于心脏、肾脏等器官移植,肝脏移植免疫排斥较轻,但临床工作中,肝移植病人术后仍需长期服用免疫抑制剂。免疫抑制剂的长期服用不仅给患者带来了沉重的经济负担,而且会导致严重的副作用,如高血压、高血脂、糖尿病、肾衰以及恶性肿瘤的发生。因此,研究如何诱导肝移植免疫耐受成为抑制肝移植术后免疫排斥反应的一个新方向。研究发现,对大鼠进行肝移植后再进行心脏或肾脏移植,心脏和肾脏的免疫排斥明显减轻,结合肝移植较其他器官移植免疫排斥轻的特点,我们考虑,肝细胞本身可能在免疫耐受的诱导中发挥着至关重要的作用。为了明确肝细胞在肝移植免疫耐受诱导中的作用,观察供体肝细胞预输注对肝移植效果的影响,我们进行了本实验。本研究主要服务于临床活体肝移植,因为对于尸体供肝,很难在术前获得供体肝细胞,但对于活体肝移植,在移植前通过腹腔镜活检可以获得供体肝细胞,同时对供肝质量有一个直观的认识。目的:明确供体肝细胞预输注对大鼠肝移植效果及免疫耐受的影响。方法:Wistar大鼠和SD大鼠各45只,随机分为3组,每组供体和受体各15只,每组随机再分为两小组,10只进行实验检测研究,5只用于观察长期生存时间;均行Wistar大鼠→SD大鼠的原位肝移植术。具体分组如下:肝细胞组:肝移植术前14d将1ml供体肝细胞(2×10~7/ml)经受体阴茎背静脉输注。骨髓细胞组:肝移植术前14d将1ml供体骨髓细胞(2×10~7/ml)经受体阴茎背静脉输注。空白对照组:肝移植术前14d将1ml生理盐水经受体阴茎背静脉输注。以上三组均在处理后14d行原位肝移植术,剔除术后24h内死亡的大鼠,用于检测研究的大鼠在肝移植术后7d处死,计算术后7d生存率,取每只受体大鼠的血液检测ALT、AKP和ALB,同时获取移植肝进行普通病理和免疫组化检测;记录用于观测生存时间的每只大鼠自发死亡时间并进行三组生存时间的比较。结果:与骨髓细胞组和空白对照组相比,肝细胞组大鼠术后7d生存率、ALB水平和FasL阳性肝细胞数显著增高,生存时间显著延长,排斥活动指数(RAI)、ALB和AKP水平则显著降低(P＜0.05),骨髓细胞组和空白对照组的以上指标相比较无统计学意义(P＞0.05)。结论:(1)供体肝细胞输注能显著延长肝移植术后受体存活时间,提高其生存率。(2)供体肝细胞输注能减轻移植肝的炎性细胞浸润和胆管损伤,同时能增加FasL阳性肝细胞的数量以诱导浸润性淋巴细胞的凋亡,有效的诱导大鼠肝移植免疫耐受,其效果优于供体骨髓细胞。第二部分:供体肝细胞诱导的肝移植免疫耐受过继性转移及其特异性的研究研究背景:器官移植免疫耐受具有以下特点:①特异性,即对特定的抗原不发生免疫反应,但对其他抗原可发生正常的免疫反应;②过继性转移性,即可通过耐受动物的脾细胞将免疫耐受转移给另一动物。在第一部分实验中,研究结果证实了供体肝细胞预输注可以减轻受体对移植肝的免疫排斥反应,有效的诱导肝移植的免疫耐受,但没有进一步研究供体肝细胞诱导的免疫耐受是否具有过继性转移及其特异性的特点。目的:明确第一部分实验中肝细胞诱导的免疫耐受是否具有过继性转移的特点,并研究其特异性。方法:把第一部分实验中在肝移植术后第20d仍存活的产生免疫耐受的SD大鼠在第20d处死,用常规方法分离脾细胞,然后分离没有进行肝移植的SD大鼠脾细胞。16只Wistar大鼠和8只Lewis鼠做供体,与24只SD受体大鼠随机配对,16只Wistar大鼠分为两组,8只Lewis大鼠为一组,每组供受体各8只。A组:将1ml(2×10~7个/ml)来源于耐受大鼠的脾细胞从受体阴茎背静脉注射,14d后进行Wistar鼠→SD鼠的肝移植手术。B组:将1ml(2×10~7个/ml)来源于未行肝移植手术的SD大鼠的脾细胞从受体阴茎背静脉注射,14d后进行Wistar鼠→SD鼠的肝移植手术。C组:将1ml(2×10~7个/ml)来源于耐受大鼠的脾细胞从受体阴茎背静脉注射,14d后进行Lewis鼠→SD鼠的肝移植手术。观查三组动物的生存时间,以明确处理因素对受体生存时间的影响,自然死亡的大鼠取其肝脏制作病理标本,观察免疫排斥情况。结果:A组的生存时间显著长于B组和C组,常规病理示生存时间超过14d的A组动物移植肝损害程度比B组和C组轻。结论:(1)供体肝细胞诱导的肝移植免疫耐受可以经过脾细胞进行过继性转移,并且具有供体特异性。(2)脾脏内的T细胞可能在供体肝细胞诱导的免疫耐受过继性转移过程中起重要作用。第三部分供体肝细胞诱导肝移植免疫耐受机制的初步研究研究背景:前两部分的研究结果证实供体肝细胞确实能有效的诱导肝移植的免疫耐受,并且这种免疫耐受可以经过耐受动物的脾细胞进行过继性转移,同时具有供体特异性。现在存在的问题是既然供体肝细胞在输入到受体后都定居于受体肝内,而受体肝脏在经过肝移植后就被切除了,那么供体肝细胞也就相应被移除了,为什么供体肝细胞输注还能诱导肝移植的免疫耐受?一个可能的原因就是在过去的两周内,定居于受体肝内的供体肝细胞可能通过改变某种机制影响了受体免疫系统,导致了细胞毒性T细胞对供体肝细胞的无反应性,从而对供体肝脏有了特异性的耐受。目的:明确供体肝细胞输注到受体后对受体免疫系统的影响,探讨其诱导肝移植免疫耐受的机制。方法:先取Wistar大鼠处死,获取其肝脏及股骨并提取肝细胞及骨髓细胞,制成2×10~7/ml的细胞悬液,肝细胞和骨髓细胞的提取及悬液制备见第一部分。另取24只SD大鼠,随机分为3组,每组8只:Ⅰ组:1ml供体肝细胞(2×10~7/ml)经受体阴茎背静脉输注。Ⅱ组:1ml供体骨髓细胞(2×10~7/ml)经受体阴茎背静脉输注。Ⅲ组:1ml生理盐水经受体阴茎背静脉输注。在输注供体肝细胞、骨髓细胞和生理盐水后14d,将所有大鼠处死,下腔静脉抽血,检测IL-10及TNF-α的血清水平。结果:与Ⅱ组和Ⅲ组相比,Ⅰ组的IL-10水平(95.2±22.7pg/ml)显著升高(P＜0.05),TNF-α水平(327.4±46.9 pg/ml)显著降低。结论:(1)与骨髓细胞相比,将供体肝细胞输注到受体的两周内,能显著增加受体大鼠血清IL-10的水平,IL-10水平的升高可能是供体肝细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的机制之一。(2)与骨髓细胞相比,供体肝细胞输注能显著同时降低TNF-α的水平,有利于免疫耐受的诱导。