甲基对硫磷水解酶(methyl parathion hydrolase，MPH)是由mpd基因编码的可溶性单体蛋白，属于金属β-内酰胺酶超家族(metallo-β-lactamase superfamily)，可以高效降解甲基对硫磷，还可以降解杀螟松、乙基对硫磷和毒死蜱，但对毒死蜱的降解效果远不如甲基对硫磷。酶分子定向进化技术为酶的分子改造提供了高效手段。此技术不仅是蛋白质定向改造的强有力工具，而且是蛋白质结构-功能关系研究的重要手段。本研究在前期研究的基础上对MPH进行了原核表达，随机突变及点饱和突变，结合计算机分子模拟初步分析酶活变化的原因，并对酶活提高的突变酶的酶学性质及底物特异性进行分析，主要结果如下：　　构建了MPH的原核表达载体MPH-PGEX，MPH重组菌株经0.5 mmol/L IPTG22℃诱导可以表达出61Ku的GST融合蛋白，且在上清中表达量较高，6 h达到最高表达量。MPH粗酶液对甲基对硫磷降解率达到92.91％，酶活力为15.66×10-5 U/mg蛋白；对毒死蜱的降解率为56.30％，酶活力为7.12×10-5 U/mg蛋白。　　采用易错PCR的方法对MPH进行随机突变，共筛选到7个突变体，分别命名为Ran-M1～M7，其中Ran-M5对毒死蜱的降解酶活力为11.10×10-5 U/mg蛋白，比MPH提高了55.94%，其他突变体对毒死蜱的降解酶活力较MPH均有不同程度的降低。突变体Ran-M7降低幅度最大，降低了74.62％。　　通过计算机模拟MPH与甲基对硫磷和毒死蜱的分子对接分析，确定进行点饱和突变的氨基酸位点为Leu67。采用重叠引物PCR(OE-PCR)及重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法对该位点进行点饱和突变，并测定了突变酶对毒死蜱的降解活性，共得到三种对毒死蜱的降解活性显著提高的突变酶：Satu-F(L67F)、Satu-T(L67T)和Satu-V(L67V)。与MPH相比，Satu-F、Satu-T和Satu-V对毒死蜱的降解活性分别提高了68.96％、64.27％和20.85%。　　通过同源建模及与毒死蜱的分子对接对突变酶的结构与功能进行初步分析，结果发现MPH及部分随机突变体(Ran-M1，Ran-M4和Ran-M5)的R72与毒死蜱形成氢键而产生强烈作用。Ran-M5的R72与毒死蜱的相互作用能为-10.230 Kcal/mol，高于MPH的-9.568 Kcal/mol。此外，Ran-M5的组氨酸富集区的H147和H152也直接参与了与毒死蜱的相互作用。在饱和突变体中，活性提高的Satu-F、Satu-T和Satu-V与毒死蜱的相互作用能均比MPH大，在一定程度上有利于酶活性的增强。　　以毒死蜱为底物，分别测定了MPH、Ran-M5、Satu-F、Satu-T和Satu-V的酶学性质，结果如下：MPH与Satu-V的最适温度为40℃，Ran-M5和Satu-F的最适温度为45℃，而Satu-T的最适温度为35℃；MPH、Ran-M5、Satu-F和Satu-V的最适pH均为9.0，Satu-T的最适pH为8.0，但均在pH为7.0左右时最稳定；MPH及突变体均有较好的温度稳定性，50℃放置1 h对毒死蜱的残留降解酶活力仍能保持在80％以上，而60℃时放置1 h残留酶活力仅剩50%左右，70℃时酶活力在较短时间迅速下降，1 h后基本丧失活性；Fe2+、Zn2+和Mn2+对酶活具有一定的激活作用，且Zn2+激活作用最强，而K+、Ag+、Mg2+、Cu2+、Hg2+、Al3+和Fe3+则不同程度抑制了酶的降解活性，且Hg2+的抑制作用最为明显。　　通过双倒数作图法求得MPH、Ran-M5、Satu-F、Satu-T和Satu-V对毒死蜱的动力学参数。Satu-F的Km值最小，为0.6577×10-3μmol·L-1，与毒死蜱的亲和力最大；Vmax为MPH的2.84倍，Kcat为MPH的2.98倍，而其专一性常数Kcat/Km则为MPH的5.66倍，说明其对毒死蜱的专一性水解能力提高。　　为了进一步研究MPH及突变酶的底物特异性，分析了MPH及突变酶粗酶液对不同种类农药的降解效果。与MPH相比，四种突变体对毒死蜱的降解效果显著提高；饱和突变体Satu-F对甲基对硫磷的降解率达到97.9％，较MPH提高了5.37％。随机突变体Ran-M5对辛硫磷的降解效果较MPH略有降低，但仍达到92.87％；对乐果的降解效果比MPH提高了30.46％。其他突变酶对上述三种农药的降解效果与MPH相差不大。对于MPH降解效果极低的三唑磷、高效氯氰菊酯和茚虫威，4种突变体的降解效果均未发生明显变化，其降解率均低于3％。