中华蜜蜂(Apis cerana cerana Fabricius)作为我国特有的蜂种,能够适应山林地区复杂的地形,且耐寒性比西方蜜蜂要强,故对初春、晚秋山林地区植物的传粉有重要的生态和经济意义。即便如此,中蜂在越冬期间死亡率仍较高,因此越冬管理一直是困扰中蜂业发展的重要因素。在对西方蜜蜂的研究中,有证据表明脯氨酸可能是一种重要的抗冻剂。本研究在系统检测脯氨酸对中华蜜蜂耐寒性能指标影响的基础上,结合转录组分析方法,探讨了脯氨酸作为一种越冬饲料添加剂的可能。本研究结果将有助于优化蜜蜂越冬饲料的配制,从而提高中华蜜蜂的越冬成功率。本研究的主要结果如下:1.测定不同季节中蜂主要耐寒生理指标,发现中蜂成虫的过冷却点(SCP)和结冰点(FP)、含水量、脂肪含量、糖原含量以及蛋白含量呈现出明显的季节变化,其中越冬期间SCP、自由水含量、糖原含量较生长季节降低,而结合水含量、脂肪含量和蛋白含量较生长季节升高。由此可见,蜜蜂在越冬时可以通过降低SCP,减少体内自由水含量,增加脂肪含量、糖原含量、蛋白含量来抵御寒冷。2.将不含脯氨酸的糖水与含1%、3%、4.35%脯氨酸的糖水饲喂越冬蜂2周,测定其过冷却点SCP,发现添加脯氨酸有利于中蜂越冬,且饲喂含1%脯氨酸糖水的中蜂越冬效果最佳。将不含脯氨酸的糖水与含1%脯氨酸的糖水饲喂越冬蜂2周后(CO、C1),测定耐寒生理指标发现,饲料中添加脯氨酸可以使SCP、FP和自由水含量降低,并且使糖原含量、蛋白含量增加,从而帮助中蜂安全越冬。3.通过对 LTO、LT1、NTO、NT1(LTO:0%,0℃;LT1:1%,0℃;NTO:0%,25℃;NT1:1%,25 ℃)4组处理的12个样本进行RNA-seq,共获得了clean data 82.20 GB,各样本的数据量均在6.2 GB以上,Q30值在93.6%-94.6%之间。以LT0-LT1、LT0-NT0、NT1-LT1、NT1-NT0比较分别获得差异表达基因820个(上调基因408个,下调基因412个)、644个(上调基因307个,下调基因337个)、229个(上调基因129个,下调基因100个)、673个(上调基因287个,下调基因396个)。不饲喂脯氨酸与饲喂1%脯氨酸的中蜂在低温处理后共有的差异表达基因有28个(LT1-NT1 vs LTO-NTO)。不饲喂脯氨酸与饲喂1%脯氨酸的中蜂在常温与低温下共表达的差异基因有45个(LT0-LT1 vs NTO-NT1)。转录组数据的分析结果显示,在低温环境下中蜂可以通过以下方式来适应寒冷环境:(1)低温胁迫下,中蜂通过改变Glycolysis/Gluconeogenesis途径中DLAT PDHB、AKR1A1、GALM、NAGLU基因的表达量,使TCA循环减弱,糖原利用减少,储备能量来御寒;同等条件下在中蜂的饮食中添加脯氨酸同时也使糖酵解途径减弱,Insulinresistance、Glucagon signaling pathway 被激活,进而使体内糖原的含量增加,能够适应更寒冷的环境。(2)低温胁迫下,中蜂通过改变甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径中DLD、PHGDH、CHDH、GRHPR等基因的表达量,以及酪氨酸、丙氨酸、色氨酸代谢等途径来增加体内游离氨基酸的含量,从而增强蜜蜂的耐寒性。而中蜂在饲喂含脯氨酸的糖水后,可能是其体内氨基酸的代谢途径减少,蛋白质含量增多,此时中蜂不需要产生更多的氨基酸也能御寒,从而提高耐寒性。(3)低温胁迫下,中蜂通过改变脂代谢途径中CPT1A、ACSBG、ACADSB、GCDH等基因的表达量,使中蜂体内脂代谢增强,产生能量来御寒。而饮食中添加脯氨酸对脂代谢的影响并不明显。4.利用qRT-PCR对转录组中的8个差异表达基因的表达量进行验证,实验结果与测序结果一致,说明RNA-seq数据可靠。